Свободные радикалы

     Как видно, пероксинитрит представляет собой связующее звено двух высокоактивных низкомолекулярных кислород- и азотсодержащих систем: АФК и АСА (активные соединения азота). Пероксинитрит может разлагаться с образованием

     Протонированный пероксинитрит так же, как и пероксид водорода, выполняет функции диффундирующей «скрытой» формы гидроксид-радикала.

     Установлено, что пероксинитрит и его протонированная форма, диффундируя в клетке и проникая через мембраны с помощью переносчиков анионов, имеют уникальный спектр химической реактивности: разрывы цепочек и окисление оснований ДНК, нитрование гуанина и белков, окисление липидов биологических мембран и т.д. Результатом многих таких реакций могут быть цитогенетические эффекты и мутагенез.

     NО является источником не только пероксинитрита и гидроксид-радикала, но и синглетного кислорода, который образуется при реакции моноксида азота с пероксидом водорода.

     Сильные окислители ·NO и ONO₂^-, обладая высокой реакционной способностью, могут влиять на цепные свободнорадикальные реакции. Их оксидазная активность во многом связана со способностью АСА модифицировать уровень продуктов перекисного окисления липидов. 
 

Продукты цепных реакций перекисного окисления липидов 

     Перекисное окисление липидов исследовано не только в модельных системах, но и на всех уровнях организации живого и имеет свои особенности в норме и патологии клетки.

     Известно, что биологические мембраны способны подвергаться интенсивной окислительной деградации, так как ненасыщенные участки жирных кислот (линоленовой, арахидоновой и др.) фосфолипидов чрезвычайно чувствительны к окислению.

     Многочисленные данные молекулярной биологии показали, что при различных патологиях, в том числе и при лучевом поражении, одной из первых клеточных структур повреждается мембрана митохондрий.

     Лучевые оксидативные изменения структуры и функций БМ (повреждения фосфолипидного барьера) приводят к дальнейшему нарушению регуляции окислительно-восстановительного равновесия, возрастанию мембранной проницаемости, дезинтеграции внутриклеточных процессов, выравниванию градиентов с фатальным для клетки исходом.

     Большое содержание полиненасыщенных жирных кислот в фосфолипидах определяет высокую способность БМ к неферментным цепным реакциям окисления и образованию инициаторов и продуктов окисления, обладающих оксидазной активностью. В результате цепных реакций липопероксидации образуются свободные радикалы, гидроперокси-ды — LOOH и другие молекулярные ППОЛ.

     Первичная роль в зарождении неферментивных цепных процессов ПОЛ в клетке, как и in vitro, принадлежит свободным электронам, донорами которых могут служить Fe²⁺, Cu²⁺, семихиноны; сигнально-пусковыми продуктами являются, как известно, , Н₂О₂, ОН· и NО·. В инициировании цепных реакций могут принимать участие и другие продукты АКСС, проникающие в липиды БМ.

     Биологическая значимость цепного процесса, инициированного в клетке, заключается в том, что он способствует накоплению токсических продуктов окисления в связи с их многократным циклическим воспроизведением.

     Цепной процесс липопероксидации в клетке протекает в такой последовательности:

     1. Молекулы ненасыщенных жирных кислот липидов LH окисляются преимущественно радикалом ОН' (или другими АКСС):

     2. Образовавшиеся радикалы липида L· претерпевают в клетке дальнейшее окисление с помощью молекулярного кислорода или с большей вероятностью — АКСС (АФК, NO-системами). Появляются пероксил- и алкоксил-LO·-радикалы

     3. Далее происходят реакции

     В процесс вовлекаются все новые и новые молекулы липидов LH и активных форм кислорода. В результате накапливаются гидропероксиды LOOH. Число радикалов L·, LO· (или LО₂) не изменяется (принцип неуничтожимости свободной валентности, «бессмертия свободных радикалов»), хотя структурно радикалы могут отличаться друг от друга.

     4. Образующиеся липидные гидропероксиды вступают в реакциюс радикалами ОН· (которые могут мигрировать в клетке на большие расстояния с помощью пероксида водорода или пероксинитрита):

     или с радикалом LO·:

и осуществляют вторичное инициирование цепи реакции и протекание разветвленных свободнорадикальных цепных процессов.

     5. При окислительном распаде липидных гидропероксидов образуются высоко лабильные ППОЛ, представляющие собой жирнокислотные фрагменты, содержащие пероксидные, эпоксидные,альдегидные и кетонные группы. Лишь в последние годы, бла годаря применению высокочувствительных аналитических методов, удалось идентифицировать некоторые из ППОЛ и показать исключительно важную их роль в биологии клетки.

     Радиационно-биофизические исследования цепных свободно-радикальных механизмов вызвали резкий приток работ, посвященных роли липопероксидации в патогенезе очень многих, самых разнообразных клеточных патологий и заболеваний организма. Однако не менее важными являются и другие работы, на основе которых сформировались представления и о биологической роли ППОЛ в условиях физиологической нормы.

     Процессы ПОЛ широко распространены в нормальной жизнедеятельности клетки. Биологическая роль ППОЛ и их связь с активными формами кислорода и NО подтверждается работами, в которых показано, что синтез тканевых гормонов — простагландинов, лейкотриенов и др. — нуждается в образовании перекисей ненасыщенных жирных кислот.

     В настоящее время хорошо известна важная биологическая роль взаимного влияния активности ППОЛ и физико-химических свойств липидного бислоя БМ. Так, ППОЛ оказывают значительное влияние на функционирование плазматических и внутриклеточных БМ, обладая способностью включаться в механизмы формирования, разборки и обновления их структуры, являясь физиологическими регуляторами важнейших функций и универсальными модификаторами структуры БМ

     Установлена зависимость интенсивности реакций липопероксидации от степени ненасыщенности жирных кислот и состояния структурной организации биологических мембран: молекулярной подвижности липидов, прочности липид-липидных и белок-липидных взаимодействий Интенсивность свободнорадикальных процессов перекисного окисления липидов, находящихся под контролем АКСС, эндогенных антиокислителей и активности ферментов, взаимосвязана с составом и физическим состоянием фосфолипидов биологических мембран (текучестью, окисляемостью и др.), с чувствительностью их рецепторов к сигналам лигандов. Активация ПОЛ ведет к ускорению выхода легко окисляемых липидов из БМ и обогащению их липидов резистентными к окислению фракциями. Это в свою очередь замедляет скорость ЛПО и возвращает этот процесс к норме. 
 

Окислительные процессы в облученной клетке

     Радиационные изменения окислительно-восстановительного равновесия в живых системах начинаются уже сразу, с момента передачи энергии ионизирующих излучений биоорганическим молекулам. В процессе ионизации происходит образование электронов, которые представляют особый интерес с биологической точки зрения, так как вызывают поляризацию и окисление молекул. Электроны в водной среде стабилизируются до гидратированного состояния, превращаясь в е^-_гидр , способные диффундировать на значительные молекулярные расстояния и эффективно взаимодействовать с молекулярным кислородом, повышая уровень содержания супероксида О₂ (и других окислительных радикалов и продуктов) не только в водных растворах, но и в облученной клетке. Другая часть электронов окисляет биоорганические молекулы, первоначально превращая их в катионы и радикалы.

     Известно, что ионизирующие излучения могут индуцировать в клетке образование пероксинитрита. Уже первые работы (В.Д.Микоян и др., 1994) показали, что его содержание в облученной клетке возрастает за счет усиления активности NO-синтазы. Накапливающиеся в облученной клетке оксипродукты ОН·, Н₂О₂ и высоко эффективны и могут быть отнесены к радиотоксинам (АКСС-радиотоксины — АКССрт). Важным свойством АКССрт является их «пусковая» способность — инициировать и усиливать цепной процесс перекисного окисления и инициировать образование сильных и относительно долгоживущих окислителей — ППОЛ. В облученной клетке избыточно накопленные ППОЛ известны под названием «липидных радиотоксинов» (ЛРТ). Они образуются, в основном, при окислении полиненасыщенных жирных кислот фосфолипидов БМ.

     Обе группы радиотоксинов АКССрт и ЛРТ объединяются под общим названием оксирадиотоксины (ОРТ). Они вызывают в клетках и тканях облученного организма повреждения, приводящие к так называемому лучевому токсическому эффекту.

     В начальный период после облучения в клетке происходит нарушение баланса между образованием ОРТ и антиокислителями. Эти изменения неспецифичны для ионизирующих излучений и известны под названием оксидативного стресса. Вначале при этом защитные антиокислительные ресурсы клетки активируются и сдерживают выход окислителей из стационарного режима. Затем, по мере развития лучевого поражения, содержание антиокислителей постепенно исчерпывается, и накопление радиотоксинов приобретает бесконтрольный характер.

     Известно, что содержание АКССрт и ЛРТ может увеличиваться не только в липидах, но и в водной фазе клетки. Поэтому эти продукты способны взаимодействовать с обоими радиационными клеточными мишенями — БМ и ДНК. Результат этих взаимодействий — дальнейшее изменение системы окислительно-восстановительного гомеостаза, перестройка физико-химической регуляции метаболизма в клетке, нарушение барьерно-матричных свойств БМ, образование аддуктов [ОРТ ДНК]. Участвуя в непрямом действии излучений, ОРТ, и в частности ЛРТ, вызывают хромосомные аберрации, мутации, вовлекаются в формирование радиационно-индуцируемой нестабильности генома.

     В экстремальной стадии оксидативных повреждений происходят многоэтапные и значительные цитогенетические повреждения мишеней, завершающиеся гибелью облученной клетки. 

Радиотоксины

     Понятие о радиотоксинах возникло еще в начале прошлого столетия. Ряд немецких радиобиологов-биохимиков вели поиски эндогенных «клеточных ядов», образующихся под действием излучений. Предполагалось, что эти «яды» могли быть гистамином, холином, какими-то иными низкомолекулярными продуктами распада белков. Строились гипотезы о роли этих и других веществ в зарождении и формировании лучевой болезни.

     Однако достаточно глубоко рассматривать возникающие гипотезы не представлялось возможным ввиду отсутствия в то время знаний о механизмах действия ионизирующих излучений и данных о химической идентификации веществ, выделяемых из облученных организмов. Позднее делались попытки найти сходство в эффектах облучения и действия бактериальных экзотоксинов или синтезированных препаратов — иприта, эмбихина, мильерана и их аналогов, имитирующих действие ионизирующей радиации (радиомиметиков), а также эндогенных хиноноподобных веществ и липидов.

     Радиобиологи ряда лабораторий мира часто обращались к мысли, что многие проявления лучевого поражения можно объяснить образующимися при облучении токсическими веществами. На роль радиотоксинов в развитии лучевого поражения указывали многочисленные исследования по введению экстрактов, выделенных из облученных организмов, интактным биологическим объектам; по дистанционному действию излучений; эксперименты с парабионтами .Все больше укреплялось предположение, что токсичность является результатом появления в облученных клетках избыточных концентраций продуктов обычного метаболизма, но в условиях выхода его из нормального режима, а не появления новых, чуждых для организма веществ.

     Подводя итог этим исследованиям, Б.Н.Тарусов еще в 1954 г. отмечал, что анализ развития лучевого поражения во времени позволяет говорить о механизмах усиления незначительных первичных радиационных повреждений — образования активных «первичных токсинов» (тогда еще не идентифицированных), действие которых является пусковым для автокаталитической цепной реакции.

     Б. Н. Тарусов выдвинул и развил теорию свободнорадикальных цепных процессов лучевого поражения клетки и организма, сводящуюся в основном к следующим трем положениям.

• Ионизирующая радиация не вызывает несвойственные для организма какие-то новые процессы, а активирует свободнорадикальные цепные реакции окисления, находящиеся в интактных клетках в стационарном режиме и обычно протекающие с малой скоростью.
• Основным субстратом первичных лучевых цепных процессов перекисного окисления в клетке являются легко окисляемые биолипиды (т. е. фосфолипиды, содержащие полиненасыщенные жирные кислоты).
• Процессы перекисного окисления развиваются по кинетике цепных разветвленных реакций в присутствии ингибиторов, поэтому в этих реакциях большое значение приобретает и характер природных ингибиторов окислительных реакций — антиоксидантов, с количеством и качеством которых связана в значительной мере радиочувствительность организма.