Свободные радикалы

     Перечисленные в таблицах 1 и 2 радикалы можно считать  природными, поскольку они в определенном количестве всегда образуются в наших  клетках. Наряду с этими радикалами разрушительное действие могут оказывать радикалы, появляющиеся при таких воздействиях, как ионизирующее излучение, ультрафиолетовое облучение или даже освещение интенсивным видимым светом, например, светом лазера. Такие радикалы можно назвать чужеродными. К ним принадлежат также радикалы, образующиеся из попавших в организм посторонних соединений, ксенобиотиков, многие из которых оказывают токсическое действие именно благодаря свободным радикалам, образующимся при метаболизме этих соединений.

     Свободнорадикальные процессы в облученных организмах в разных тканях облученных животных не одинаковы. Так, в одной группе тканей и клеток (головной мозг, скелетные мышцы, эритроциты) после облучения животных в дозах 6-15 Гр не обнаружены пострадиационные изменения содержания свободных радикалов; в другой (печень и почки) происходит усиление процесса сополимеризации на первые-вторые сутки после облучения; в третьей группе (плазма крови, селезенка) наблюдаются фазовые изменения количества свободных радикалов в ткани. В плазме крови в течение двух суток после облучения происходит непрерывное увеличение концентрации свободных радикалов, интенсивность накопления которых зависит от дозы излучения в широком диапазоне. Еще ранее было показано, что основное количество активных оксипродуктов («радиотоксинов») возникает в тканевых ненасыщенных липидах, количество токсических продуктов возрастает в зависимости от величины дозы и времени, прошедшего после облучения.

     Фундаментальные исследования, экспериментально подтвердившие важнейшую роль свободных радикалов и антиоксиданов, регулирующих их уровень, в развитии лучевого поражения клетки и организма проводились в радиобиологических школах Н. М. Эмануэля и Б. Н. Тарусова. Получены многочисленные данные, указывающие на связь между количеством индуцируемых излучением свободных радикалов и степенью лучевого поражения клеток. Большинство таких данных получено с использованием методов, позволяющих регулировать уровень и дальнейшее превращение свободных радикалов в облученной клетке.

     Активные кислород-содержащие соединения — АКСС — принимают непосредственное участие в зарождении и развитии нарушений системы окислительно-восстановительного равновесия в облученной клетке. 
 

Система окислительно-восстановительного гомеостаза клетки и ее изменения после облучения

     Известно, что система окислительно-восстановительных процессов составляет основу жизнедеятельности клетки и организма, а кислород играет ключевую роль в энергетике дыхания нормальных аэробных клеток, являясь единственным акцептором электронов.

     Основное количество молекулярного кислорода в клетке — 90-98% расходуется в реакциях тканевого дыхания и микросомального окисления, катализируемых соответственно митохондриальной цитохромоксидазой, а также и другими оксидазами, в результате чего в дыхательных цепях происходит запасение энергии и осуществляется четырехэлектронное восстановление О₂ с образованием двух молекул воды:

     Значительно реже под действием ферментов — оксигеназ — происходит включение одного из атомов кислорода в биоорганические молекулы:

     О₂ + М + 2Н

     Так, важную роль в окислении ненасыщенных липидов играют ферментные реакции, катализируемые липоксигеназами и циклооксигеназами — первыми ферментами на путях образования специфических регуляторов метаболизма — эйкозаноидов.

     Около 2% поглощаемого кислорода восстанавливается самопроизвольным, неферментативным путем. Эти реакции всегда начинаются с присоединения к молекуле О₂ одного электрона и образования аниона-радикала (содержащего неспаренный электрон) — супероксида :

     Донорами электронов в клетке служат Fe²⁺, Cu⁺, семихинон и другие промежуточные участники процессов тканевого дыхания, а под воздействием ионизирующей радиации, как известно, электроны генерируются вследствие ионизации воды и биоорганических молекул.

     В основном состоянии молекулярный кислород парамагнитен — представляет собой триплет — «бирадикал», т. е. имеет два неспаренных электрона (с параллельными спинами) на различных орбиталях. По этой причине прямые, неферментативные реакции с кислородом могут осуществляться по свободнорадикальным механизмам. Большинство органических молекул синглетны (электроны с антипараллельными спинами), поэтому, вследствие различий с триплетным кислородом в направлении спинов, их реакции с молекулярным кислородом из-за спиновых запретов затруднены и протекают очень медленно. Кинетические барьеры одноэлектронного восстановления кислорода в клетке достаточно высоки, поэтому образование супероксида процесс медленный, однако он очень важен для формирования системы окислительно-восстановительного гомеостаза в клетке, так как J участвует в генерации многих окислителей — активных кислород-содержащих соединений — АКСС. 
 

Активные формы кислорода

     К активным формам кислорода (АФК) относятся свободные радикалы — супероксидный анион-радикал (супероксид), гидроксид- и гидропероксид (пергидроксид)-радикалы и нейтральные молекулы — пероксид водорода и синглетный кислород .

     АФК обнаруживаются в клеточных органеллах. Главными местами их образования являются митохондриальная, ядерная, плазматическая и микросомальная мембраны у животных, хлоропласты и хроматофоры у растений.

     В клетке существуют ферментный и неферментный пути образования АФК. Метаболические, ферментные пути образования АФК, участвующие в нормальной жизнедеятельности клетки, представлены в схеме Бурлаковой-Михайлова-Мазурика.

     В ферментной генерации АФК участвуют: дыхательная цепь митохондрий и система микросомального окисления, системы оксидаз (ксантин-, флавин-, НАДФ.Н*-оксидазы) и цитохромов, глутатионпероксидаза и супероксиддисмутаза (СОД).

     Неферментативное образование основных АФК и их превращения происходят по схеме, изображенной на рис. 1, в следующих реакциях

Рис.1. Схема последовательности образования АФК в клетке в цепи неферментного одноэлектронного восстановления кислорода до воды

     Синглетный кислород, содержащийся в хлоропластах растений и в зрительных рецепторах животных, занимает особое место среди АФК. Образование его здесь связано не только с реакцией, а преимущественно с фотохимическими процессами. Поглощая квант света, пигмент-фотосенсибилизатор переходит в синглетное, а затем в триплетное возбужденные состояния. В обоих возбужденных состояниях молекулы пигмента взаимодействуют с молекулярным кислородом, передают ему свою энергию и превращают его в активный окислитель.

     Супероксид при взаимодействии с органическими биомолекулами обладает слабой реакционной способностью, так как имеет невысокий окислительно-восстановительный потенциал. Однако он выполняет важную роль, продолжая дальнейшую цепь одноэлектронного восстановления кислорода путем образования молекулы пероксида (перекиси) водорода Н₂О₂.

     Пероксид водорода — сильный окислитель и образуется при реакции супероксида с электроном и двумя протонами:

     Экспериментально показано, что гидроксид-радикал относится к наиболее эффективным окислителям АКСС.

     Биологическая роль АФК может осуществляться в жизненно необходимых реакциях иммунитета и воспаления: АФК способствуют образованию цитокинов и иммунных рецепторов, миграции лейкоцитов в «аварийные ткани», выполняют бактерицидную функцию в фагоцитозе.

     Известно, что возрастающий уровень ¹О₂ может быть причиной обновления «отработанных» субклеточных компонентов фоторецепторов, а также фотодинамического действия пигментов в клетках, не имеющих фоторецепторных систем.

     В конце XX в. получены данные о способности АФК выполнять сигнальную функцию в клеточной регуляции. Показано, что АФК стимулируют накопление цАМФ и цГМФ, ионов Са²⁺ в цитозоле, активацию протеинкиназ, протеинтирозинкиназ и подавление активности протеинфосфатаз. Помимо стимуляции процессов фосфорилирования белков, АФК активируют и белок Ras, участвующий в передаче сигналов в ядро клетки.

     Вопрос о биологической роли АФК находится также в связи с инициированием ими значимых процессов в клетке — перекисного окисления липидов.

     В настоящее время окончательно установлено, что АФК способны инициировать цепные реакции липопероксидации в норме, а их избыток — усиливать цепные процессы при лучевом поражении и других физических и химических воздействиях.

     Непрямой эффект радиации при радиолизе воды в облученной клетке был изучен давно. Однако биологическое действие ОН·и других АКСС в норме и в механизме усиления радиационных повреждений более полно стало раскрываться только в последние 10-20 лет.

     Гидроксид-радикал — чрезвычайно активный окислитель и способен разрушать фактически любую находящуюся рядом с ним молекулу в клетке. При взаимодействии с нуклеиновыми кислотами он вступает в реакции с азотистыми основаниями, образуя продукты их повреждения, а также разрушает углеводные мостики между нуклео-тидами и вызывает разрывы цепей ДНК и РНК. Благодаря этому ОН· способен вызывать мутации и гибель клеток. Взаимодействуя с другой мишенью — биологическими мембранами (БМ), гидроксид-радикал внедряется в липидный слой, инициирует цепные реакции липопероксидации, приводит тем самым к нарушениям структуры и функции мембран, инициируя процессы гибели клеток. При облучении клетки в больших дозах, действуя на тиольные белковые молекулы, ОН· денатурирует их и инактивирует ферменты Все же следует оговориться, что время жизни ОН· небольшое и гидроксид-радикал успевает диффундировать лишь на один-два молекулярных диаметра, взаимодействуя лишь с молекулами близлежащих компонентов клетки. Поэтому вероятность прямого взаимодействия его с ядерной ДНК малая. Диффундирующей «скрытой» формой гидроксид-радикала является, пероксид водорода — более длительно живущая АФК, содержащаяся в клетке в относительно больших количествах. Молекула Н₂О₂ (вступая в реакцию с ионом металла) «доставляет» ОН· в мембранные структуры и ядро клетки.

     Важнейшую роль в протекании окислительно-восстановительных реакций, к продуктам которых относятся АФК-прооксиданты, играет и недавно открытая система NО, выполняющая функции регулятора многих ключевых физиологических и биохимических процессов. 
 

Активные соединения азота

     В последние два десятилетия проведены фундаментальные исследования, открывшие новую страницу в молекулярной биологии: установлено, что, казалось бы, простое химическое соединение — моноксид азота NO, образующееся в организме из L-аргинина ферментативным путем , — выполняет функции одного из наиболее универсальных регуляторов метаболизма.

     Суммарное уравнение ферментной реакции образования NО, включающее пятиэлектронное окисление атома азота аргинина сопряженное с окислением НАДФ.Н, имеет вид:

     2 Арг+3 НАДФ.Н+4О₂+3 Н⁺ = 2 Цит+2 NО+3 НАДФ⁺+4Н₂О.

     Ферментная реакция генерации моноксида азота обеспечивается изоформами эндотелиальной и нейрональной NO-синтаз.

     Обнаружено, что активные соединения NО выполняют многообразные физиологические регуляторные функции в организме, выступая в качестве антагониста адренергической нервной системы, регулирующего по эфферентным нервам деятельность дыхательной, мочеполовой, мышечной, секреторной, сосудистой и других систем. Установлено активирующее действие NО на растворимую форму важнейшего внутриклеточного регуляторного белка — гуанилатциклазы — фермента, ответственного за синтез одного из вторичных мессенджеров — цГМФ.

     Малые размеры двухатомной газообразной молекулы N0 и отсутствие заряда позволяют ей легко проникать через плазматические и внутриклеточные мембраны. Молекулы моноксида азота легко диффундируют в биологических средах и являются относительно долгоживущими.

     Наряду с нормальными регуляторными функциями, NО, образуясь в фагоцитах в больших концентрациях, проявляет цитотоксическую активность, обнаруживая эффекторные свойства системы клеточного иммунитета.

     Установлено также, что длительная генерация NО способна вызывать патологию различного генеза. Так, наряду с другими АКСС, оксид азота и его производные являются ключевыми факторами воспаления, инфекции, канцерогенеза, а также развития радиационных, стрессорных и адаптивных ответов клеток и организма на соответствующие воздействия.

     Показано, что цитотоксические и цитогенетические эффекты обусловлены образованием чрезвычайно активного окислителя — пе-роксинитрита, возникающего в реакции взаимодействия оксида азота с супероксидным анион-радикалом: