Таможенная экспертиза товаров

         Связь эта обратима: ионы одних компонентов могут замещаться на другие или вытесняться находящимися в элюенте контрионами ионогенных групп сорбента, а также специально вводимыми для этой цели в элюент ионами. Происходит обмен ионов, поэтому сорбенты описанного типа называют  ионообменниками (ионитами).

       Выбор ионообменного сорбента  для очистки белка в значительной степени зависит от изоэлектрической точки белка — pi. При значениях рН, превышающих pi белка, его молекулы приобретают в целом отрицательный заряд и способны адсорбироваться анионным обменником. При рН ниже pi белок будет адсорбироваться катион-ным обменником. Например, если pi = 4, то в большинстве случаев целесообразно подобрать сорбент, который способен связывать белок при рН > 4. Поскольку при рН > 4 такой белок заряжен отрицательно, то сорбент должен быть анионообменником, например, с диэтиламиноэтильной функциональной группой (ДЭАЭ). Можно было бы использовать рН < 4 и катионообменник, но многие белки в таких условиях нестабильны, либо образуют агрегаты. Если, напротив, белок, который мы хотим очистить, имеет pi = 10, то он будет заряжен положительно в условиях, пригодных, как правило, для ионообменной хроматографии, т. е. при рН около 7. Таким образом, в общем, для белка такого типа мы должны выбрать катионообменный сорбент, например, с карбоксиметильной функциональной группой (КМ), которая при нейтральном рН заряжена отрицательно. 

                      Рисунок 1. Зарядовые свойства анионо- и катионообменников 

Адсорбирующая способность сорбента сильно зависит от рН и от pi разделяемых белков (рис. 1), но также от качества сорбента, прилагаемого давления и от числа прогонов колонки. 

     Чтобы увеличить срок службы сорбента, его следует тщательно промыть, хранить в подходящем растворителе и не применять рН и давление вне предписанных допустимых пределов.

     Анионообменник с ДЭАЭ имеет значительную емкость при низких и средних значениях рН=1-6; катионообменник с КМ имеет высокую емкость при высоких и средних значениях рН=6-14. 

     На представленном рисунке показаны профили сил удерживания т.н. "слабых" ионообменников, емкость которых значительно зависит от рН подвижной фазы. Также широко распространены "сильные" катионообменники, практически не меняющие  свою емкость в широком диапазоне рН. В этих ионитах в качестве ионогенных групп используются или остатки сильных кислот (например, серной) в катионообменниках, или  сильные основания (например, четвертичные амины) в анионообменниках.

     В первом случае катионообменник имеет рабочий интервал рН равен 1-14, а во втором случае - 1-11. На практике при выборе силы обменника следует учитывать множество факторов, например крупные белковые молекулы могут в неподходящих условиях необратимо связываться с "сильными" анионитами.

                               Рисунок 2 Ионообменная хроматография свободных кислот 

    Разрешающая способность хроматографического разделения зависит преимущественно от типа биомолекул, типа и качества сорбента, ионной силы градиента при элюции, от температуры и от геометрии колонки.

    Разделение сложных смесей хроматографическим способом основано главным образом на различной сорбируемости компонентов смеси. Немаловажное значение имеют также различия в растворимости, диффузии и других физико-химических свойствах.

      Как уже отмечалось, возможность фракционирования компонентов смеси веществ обусловлена здесь различием в значениях их суммарных зарядов. Последние зависят как от числа и характера ионогенных групп в молекулах, так и от полноты их диссоциации, которую можно контролировать путем выбора рН и ионной силы элюента. Чем больше в данных условиях элюции суммарный заряд того или иного компонента смеси, тем сильнее его взаимодействие с ионообменником и тем медленнее он мигрирует вдоль колонки. Так, на рисунке 3 представлен пример разделения аминокислот, имеющих разный заряд.  

                        Рисунок 3 Разделение имеющих разный заряд аминокислот.  

     На очерченный здесь основной процесс ионообменной хроматографии влияет ряд дополнительных факторов. Среди них, кроме уже фигурировавшей ранее затрудненной (особенно для крупных молекул) диффузии внутри гранул, следует назвать возможность неионной адсорбции на поверхности матрицы ионообменника. Однако при правильном выборе материала обменника, и в частности его пористости, основную роль в процессе фракционирования играет явление ионного обмена.(и)

     Актуальность: в настоящее время ионообменная хроматография широко используется. С помощью нее выделяют алкалоиды, антибиотики, ферменты, перерабатывают продукты ядерных превращений.

      Диапазон применения хроматографических методов огромен: от анализа атмосферы планет Солнечной системы до полного анализа содержимого одной живой клетки. Исключительную роль хроматография играет в химической, нефтехимической, газовой, пищевой, целлюлозно-бумажной и многих других отраслях промышленности. (и)

        На каждом из 150 крупных заводов в России в технологическом контроле постоянно функционируют от 100 до 600 газовых хроматографов. Тысячи газовых, жидкостных и ионных хроматографов эксплуатируются в лабораториях Госсанэпиднадзора, экологических центрах, токсикологических лабораториях, в учреждениях Водоканала, в лабораториях Госкомгидромета, в ветеринарных лабораториях, на станциях защиты растений, в лабораториях судебной и судебно-медицинской экспертизы.

     Различные методы хроматографии можно классифицировать по агрегатному состоянию фаз, методике эксперимента и механизмам разделения.(Д)

      2.3 История открытия и развития хроматографии

      Первооткрывателем хроматографии был русский ученый, ботаник и физикохимик Михаил Семенович Цвет. Он родился 14 мая 1872 г. в небольшом итальянском городе Асти. Его мать - итальянка, отец - уроженец Чернигова, видный государственный служащий. Цвет окончил Женевский университет, в котором получил степень доктора ботаники (1896). Приехав в Россию, он был вынужден заново защитить сначала магистерскую диссертацию (1902), а затем и докторскую диссертацию (1910).

     Значительную часть своей жизни (1903 - 1916) Цвет провел в Варшаве, а последующие годы (1916 - 1918) - в Москве, Нижнем Новгороде, Тарту. Умер он в Воронеже в 1919 г.

     Открытие хроматографии относится ко времени завершения Цветом работы над магистерской диссертацией в Петербурге (1900 - 1902) и первому периоду работы в Варшаве (1902 - 1903). Исследуя пигменты растений, Цвет пропустил раствор смеси очень мало различающихся по цвету пигментов через трубку, заполненную адсорбентом - порошкообразным карбонатом кальция, и промыл затем адсорбент чистым растворителем. Отдельные компоненты смеси при этом разделились и образовали цветные полосы. Согласно современной терминологии Цвет открыл проявительный вариант хроматографии. Основные итоги исследований по развитию созданного им варианта хроматографии Цвет изложил в книге “Хромофиллы в растительном и животном мире” (1910), которая является его докторской диссертацией.

     Цвет широко использовал хроматографический метод не только для разделения смеси и установления ее многокомпонентности, но и для количественного анализа, с этой целью он разбивал стеклянную колонку и разрезал столбик адсорбента на слои.     

     Цвет разработал аппаратуру для жидкостной хроматографии, впервые осуществил хроматографические процессы при пониженном давлении (откачке) и при некотором избыточном давлении, разработал рекомендации по приготовлению эффективных колонок. Кроме того, он ввел многие основные понятия и термины нового метода, такие как “хроматография”, “проявление”, “вытеснение”, “хроматограмма” и др.

Хроматографию сначала использовали очень редко, ее скрытый период длился около 20 лет, в течение которых появилось  лишь очень небольшое число сообщений  о различных применениях метода. И только в 1931 г. Р. Куну (Германия),

А. Винтерштейну (Германия) и Э. Ледереру (Франция), работавшим в химической лаборатории (руководимой  Р. Куном) Института императора Вильгельма по медицинским исследованиям в  Гейдельберге, удалось выделить этим методом а- и b-каротин из сырого каротина и тем самым продемонстрировать ценность открытия Цвета.

     Важным этапом в развитии хроматографии стало открытие советскими учеными Н.А. Измайловым и М.С. Шрайбер метода хроматографии в тонком слое (1938), позволяющего проводить анализ с микроколичеством вещества.

     Следующим важным шагом явилось открытие А. Мартином и Р. Сингом (Англия) варианта жидкостной распределительной хроматографии на примере разделения ацетильных производных аминокислот на колонке, заполненной силикагелем, насыщенным водой, с использованием хлороформа в качестве растворителя (1940). Тогда же было отмечено, что в качестве подвижной фазы может быть использована не только жидкость, но и газ. Несколькими годами позднее эти ученые предложили осуществлять разделение производных аминокислот на смоченной водой бумаге с бутанолом в качестве подвижной фазы. Они же осуществили первую двумерную систему разделения.

     За открытие распределительного варианта хроматографии Мартин и Синг получили Нобелевскую премию по химии. (1952). Далее Мартин и А. Джеймс осуществили вариант газовой распределительной хроматографии, разделив смеси на смешанном сорбенте из силикона ДС-550 и стеариновой кислоты (1952 - 1953). С этого времени наиболее интенсивное развитие получил метод газовой хроматографии.

     Современный этап в развитии ионообменной хроматографии начался в 1975 г. после работы Г. Смолла, Т. Стивенса и У. Баумана (США), в которой они предложили новый аналитический метод, названный ионной хроматографией (вариант высокоэффективной ионообменной хроматографии с кондуктометрическим детектированием).

     Исключительное значение имело создание сотрудником фирмы "Перкин-Эльмер" М. Голеем (США) капиллярного варианта хроматографии (1956), при котором сорбент наносится на внутренние стенки капиллярной трубки, что позволяет анализировать микроколичества многокомпонентных смесей.

     В конце 60-х гг. резко возрос интерес к жидкостной хроматографии. Появилась высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ). Этому способствовало создание высокочувствительных детекторов, новых селективных полимерных сорбентов, новой аппаратуры, позволяющей работать при высоких давлениях.

    2.4 Основы хроматографического процесса

     Для проведения хроматографического разделения веществ или определения их физико-химических характеристик обычно используют специальные приборы - хроматографы. Основные узлы хроматографа - хроматографическая колонка, детектор, а также устройство для ввода пробы. Колонка, содержащая сорбент, выполняет функцию разделения анализируемой смеси на составные компоненты, а детектор - функцию их количественного определения. Детектор, расположенный на выходе из колонки, автоматически непрерывно определяет концентрацию разделяемых соединений в потоке подвижной фазы.

     После ввода анализируемой смеси с потоком подвижной фазы в колонку зоны всех веществ, расположенных в начале хроматографической колонки. Под действием потока подвижной фазы компоненты смеси начинают перемещаться вдоль колонки с различными скоростями, величины которых обратно пропорциональны коэффициентам распределения к (или константам распределения) хроматографируемых компонентов. Хорошо сорбируемые вещества, значения констант распределения для которых велики, передвигаются вдоль слоя сорбента по колонке медленнее, чем плохо сорбируемые. Поэтому быстрее всех из колонки выходит компонент А, затем компонент Б и последним покидает колонку компонент В (КА<КБ<КВ). Сигнал детектора, величина которого пропорциональна концентрации определяемого вещества в потоке элюента, автоматически непрерывно записывается и регистрируется (например, на диаграммной ленте). Полученная хроматограмма отражает расположение хроматографических зон на слое сорбента или в потоке подвижной фазы во времени.