Определение цитокинов

Методы  определения цитокинов.

Обзор посвящен основным методам исследования цитокинов, используемым в настоящее время. Кратко охарактеризованы возможности  и назначение методов. Приведены  достоинства и недостатки различных  методик подходов к анализу экспрессии генов цитокинов на уровне нуклеиновых  кислот и на уровне продукции белка. (Цитокины и воспаление. 2005. Т. 4, № 1. С. 22-27.)

Цитокины - это  регуляторные белки, которые образуют универсальную сеть медиаторов, характерную  как для иммунной системы, так  и для клеток других органов и  тканей. Под контролем этого класса регуляторных белков протекают все  клеточные события: пролиферация, дифференцировка, апоптоз, специализированная функциональная активность клеток. Эффекты каждого  цитокина на клетки характеризуются  плейотропностью, спектр эффектов разных медиаторов перекрывается и, в основном, конечное функциональное состояние  клетки зависит от влияния нескольких цитокинов, действующих синергично. Таким образом, система цитокинов  представляет собой универсальную, полиморфную регуляторную сеть медиаторов, предназначенных для контроля процессов  пролиферации, дифференцировки, апоптоза и функциональной активности клеточных  элементов в кроветворной, иммунной и других гомеостатических системах организма. Методы определения цитокинов за 20 лет их интенсивного изучения прошли очень быструю эволюцию и сегодня представляют целую область научного знания. Перед исследователями в цитокинологии в начале работы стоит вопрос о выборе метода. И здесь исследователь должен точно знать, какую информацию ему нужно получить для достижения поставленной цели. В настоящее время разработаны сотни различных методов оценки системы цитокинов, которые дают разноплановую информацию об этой системе. Оценивать цитокины в различных биологических средах можно по специфической биологической активности. Можно определять их количественно с помощью целого ряда методов иммуноанализа, использующих поли- и моноклональные антитела. Кроме изучения секреторных форм цитокинов можно изучать их внутриклеточное содержание и продукцию в тканях методами проточной цитофлюориметрии, вестерн-блотинга и иммуногистохимии in situ. Очень важную информацию можно получать, изучая экспрессию мРНК цитокинов, стабильность мРНК, наличие изоформ мРНК цитокинов, естественных антисмысловых нуклеотидных последовательностей. Изучение аллельных вариантов генов цитокинов может дать важную информацию о генетически запрограммированной высокой или низкой продукции того или иного медиатора. У каждого метода есть свои недостатки и свои достоинства, своя разрешающая способность и точность определения. Незнание и непонимание исследователем этих нюансов может привести его к ложным выводам.

Определение биологической активности цитокинов.

История обнаружения  и первых шагов в изучении цитокинов  была тесно связана с культивированием иммунокомпетентных клеток и клеточных  линий. Тогда были показаны регуляторные эффекты (биологическая активность) ряда растворимых факторов белковой природы на пролиферативную активность лимфоцитов, на синтез иммуноглобулинов, на развитие иммунных реакций в моделях in vitro. Одна из первых методик определения  биологической активности медиаторов - определение фактора миграции человеческих лимфоцитов и фактора ее ингибиции. По мере изучения биологических эффектов цитокинов появлялись и различные методы оценки их биологической активности. Так, IL-1 определяли по оценке пролиферации мышиных тимоцитов in vitro, IL-2 - по способности стимулировать пролиферативную активность лимфобластов, IL-3 - по росту гемопоэтических колоний in vitro, IL-4 - по комитогенному эффекту, по усилению экспрессии Ia-белков, по индукции образования IgG1 и IgE и т.д. Список этих методов можно продолжать, он постоянно пополняется по мере обнаружения новых биологических активностей растворимых факторов. Главный их недостаток - нестандартность методик, невозможность их унификации. Дальнейшее развитие приемов определения биологической активности цитокинов привело к созданию большого числа клеточных линий, чувствительных к тому или иному цитокину, или мультичувствительных линий. Сейчас большинство этих цитокинчувствительных клеток можно обнаружить в списках коммерчески распространяемых клеточных линий. Например, для тестирования IL-1a и b используют клеточную линию D10S, для IL-2 и IL-15 - клеточную линию CTLL-2, для IL-3, IL-4, IL-5, IL-9, IL-13, GM-CSF - клеточную линию TF-1, для IL-6 - клеточную линию B9, для IL-7 - клеточную линию 2Е8, для TNFa и TNFb - клеточную линию L929, для IFNg - клеточную линию WiDr [19], для IL-18 - клеточную линию KG-1. Однако, подобный подход в изучении иммуноактивных белков, наряду с хорошо известными преимуществами, такими как измерение реальной биологической активности зрелых и активных белков, высокой воспроизводимостью при стандартизированных условиях, имеет и свои недостатки. К ним можно отнести, в первую очередь, чувствительность клеточных линий не к одному цитокину, а к нескольким родственным цитокинам, биологические эффекты которых перекрываются. Кроме того, нельзя исключить возможность индукции продукции других цитокинов клетками-мишенями, которые могут искажать тестируемый параметр (как правило, это пролиферация, цитотоксичность, хемотаксис). Мы знаем еще не все цитокины и не все их эффекты, поэтому оцениваем не сам цитокин, а суммарную специфическую биологическую активность. Таким образом, оценка биологической активности как суммарной активности разных медиаторов (недостаточная специфичность), является одним из недостатков этого метода. Кроме того, используя цитокинчувствительные линии, невозможно выявить неактивированные молекулы и связанные белки. Значит, подобные методики не отражают реальной продукции для ряда цитокинов. Еще один немаловажный недостаток использования клеточных линий - необходимость лаборатории для культуры клеток. Кроме того, все процедуры по наращиванию клеток, инкубированию их с исследуемыми белками и средами требуют больших временных затрат. Также нужно отметить, что клеточные линии при длительном их применении требуют обновления или повторной сертификации, так как в результате культивирования они могут мутировать и модифицироваться, что может приводить к изменению их чувствительности к медиаторам и снижению точности определения биологической активности. Тем не менее, этот метод идеален для тестирования специфической биологической активности рекомбинантных медиаторов.

Количественное  определение цитокинов  с помощью антител.

Продуцируемые иммунокомпетентными и другими  типами клеток цитокины выделяются в  межклеточное пространство для осуществления  паракринных и аутокринных сигнальных взаимодействий. По концентрации этих белков в сыворотке крови или  в кондиционной среде можно судить о характере патологического  процесса и об избытке или недостатке определенных функций клеток у больного. Методы определения цитокинов с помощью специфических антител являются сегодня самыми распространенными системами детекции этих белков. Данные методы прошли через целую серию модификаций с использованием разных меток (радиоизотопных, флюоресцентных, электрохемилюминесцентных, ферментных и т.д.). Если радиоизотопные методы имеют ряд недостатков, связанных с использованием радиоактивной метки и ограниченной по времени возможностью использования меченых реагентов (период полураспада), то иммуноферментные методы нашли самое широкое распространение. Они основаны на визуализации нерастворимых продуктов ферментативной реакции, поглощающих свет с известной длиной волны, в количествах, эквивалентных концентрации определяемого вещества. Для связывания измеряемых веществ используются антитела, нанесенные на твердую полимерную основу, а для визуализации - антитела, конъюгированные с ферментами, как правило, щелочной фосфатазой или пероксидазой хрена. Достоинства метода очевидны: это высокая точность определения при стандартизованных условиях хранения реактивов и выполнения процедур, количественный анализ, воспроизводимость. К недостаткам можно отнести ограниченный диапазон определяемых концентраций, в результате чего все концентрации, превышающие определенный порог, считаются равными ему. Необходимо отметить, что затраты времени на выполнение метода варьируют в зависимости от рекомендаций производителя. Однако в любом случае речь идет о нескольких часах, необходимых для инкубаций и отмывок реагентов. Кроме того, определяются латентные и связанные формы цитокинов, которые по своей концентрации могут значительно превышать свободные формы, в основном, ответственные за биологическую активность медиатора. Поэтому данный метод желательно использовать вместе с методами оценки биологической активности медиатора. Другая модификация метода иммуноанализа, которая нашла широкое применение - электрохемилюминесцентный метод (ЭХЛ) определения белков антителами, меченными рутением и биотином. Этот метод имеет следующие преимущества по сравнению с радиоизотопными и иммуноферментными: простота выполнения, небольшое время выполнения методики, отсутствие процедур отмывок, малый объем пробы, большой диапазон определяемых концентраций цитокинов в сыворотке и в кондиционной среде, высокая чувствительность метода и его воспроизводимость. Рассматриваемый метод приемлем для использования как в научных исследованиях, так и в клинических. Следующий метод оценки цитокинов в биологических средах разработан на основе технологии проточной флюориметрии. Он позволяет одновременно оценивать в образце до сотни белков. В настоящее время созданы коммерческие наборы для определения до 17 цитокинов. Тем не менее, преимущества этого метода определяют и его недостатки. Во-первых, это трудоемкость подбора оптимальных условий для определения нескольких белков, во-вторых, продукция цитокинов носит каскадный характер с пиками продукции в разное время. Поэтому определение большого количества белков одномоментно не всегда информативно. Общим требованием методов иммуноанализа, использующих т.н. "сэндвич", является тщательный подбор пары антител, позволяющий определять либо свободную, либо связанную форму анализируемого белка, что накладывает на этот метод ограничения, и что всегда нужно учитывать при интерпретации полученных данных. Этими методами определяется суммарная продукция цитокинов разными клетками, в то же время об антигенспецифической продукции цитокинов иммунокомпетентными клетками судить можно только предположительно. В настоящее время разработана система ELISpot (Enzyme-Liked ImmunoSpot), которая в значительной степени устраняет эти недостатки. Метод позволяет полуколичественно оценивать продукцию цитокинов на уровне отдельных клеток. Высокая разрешающая способность этого метода позволяет оценивать антиген-стимулированную продукцию цитокинов, что очень важно для оценки специфического иммунного ответа. Следующий, широко используемый в научных целях, метод - это внутриклеточное определение цитокинов методом проточной цитофлюориметрии . Преимущества его очевидны. Мы можем фенотипически охарактеризовать популяцию клеток-продуцентов цитокина и/или определить спектр продуцируемых цитокинов отдельными клетками, при этом имеется возможность относительной количественной характеристики этой продукции. Вместе с тем, описываемый метод достаточно сложен и требует дорогостоящего оборудования. Следующая серия методов, которая используется в основном в научных целях - это иммуногистохимические методы с использованием меченых моноклональных антител. Преимущества очевидны - определение продукции цитокинов непосредственно в тканях (in situ), где происходят различные иммунологические реакции. Однако рассматриваемые методы очень трудоемки и не дают точных количественных данных.[2]

Определение цитокинов методом  иммуноферментного  анализа. 

ЗАО «Вектор-Бест»  под руководством Т.Г. Рябичева, Н.А. Вараксин, Н.В. Тимофеева, М.Ю. Рукавишников ведут активную работу в направление определения цитокинов. Цитокины представляют собой группу полипептидных медиаторов, часто гликозилированных, с молекулярной массой от 8 до 80 кД. Цитокины участвуют в формировании и регуляции защитных реакций организма и его гомеостаза. Они вовлечены во все звенья гуморального и клеточного иммунного ответа, включая дифференцировку иммунокомпетентных клеток-предшественников, представление антигена, клеточную активацию и пролиферацию, экспрессию молекул адгезии и острофазового ответа. Некоторые из них способны проявлять множество биологических эффектов по отношению к различным клеткам-мишеням. Действие цитокинов на клетки осуществляется следующими путями: аутокринно — на клетку, синтезирующую и секретирующую данный цитокин; паракринно — на клетки, расположенные вблизи клетки-продуцента, например в очаге воспаления или в лимфоидном органе; эндокринно-дистанционно — на клетки любых органов и тканей после попадания цитокина в циркуляцию крови. Образование и высвобождение цитокинов обычно происходит кратковременно и жёстко регулируется. Цитокины воздействуют на клетку, связываясь со специфическими рецепторами на цитоплазматической мембране, вызывая этим каскад реакций, ведущий к индукции, усилению или подавлению активности ряда регулируемых ими генов. Для цитокинов характерен сложный сетевой характер функционирования, при котором продукция одного из них влияет на образование или проявление активности ряда других. Цитокины являются локальными медиаторами, поэтому целесообразно измерять их уровни в соответствующих тканях после экстракции тканевых протеинов из биоптатов соответствующих органов или в естественных жидкостях: моче, слёзной жидкости, жидкости дёсневых карманов, бронхоальвеолярном лаваже, вагинальном секрете, эякуляте, смывах из полостей, спинномозговой или синовиальной жидкости и др.. Дополнительную информацию о состоянии иммунной системы организма можно получить при изучении способности клеток крови к продукции цитокинов in vitro. Уровни содержания цитокинов в плазме отражают текущее состояние иммунной системы и развития защитных реакций in vivo. Спонтанная продукция цитокинов культурой мононуклеаров периферической крови позволяет оценить состояние соответствующих клеток. Повышенная спонтанная продукция цитокинов свидетельствует о том, что клетки уже активированы антигеном in vivo. Индуцированная продукция цитокинов позволяет оценить потенциальную способность соответствующих клеток отвечать на антигенную стимуляцию. Сниженная индукция цитокинов in vitro, например, может служить одним из признаков иммунодефицитного состояния. Поэтому оба варианта изучения уровней цитокинов как в циркулирующей крови, так и при их продукции культурами клеток важны с точки зрения характеристики иммунореактивности всего организма и функции отдельных звеньев иммунной системы. До недавнего времени в России изучением цитокинов занимались немногочисленные группы исследователей, так как биологические методы исследования очень трудоёмки, а импортные иммунохимические наборы весьма дороги. С появлением доступных отечественных иммуноферментных наборов все больший интерес к изучению цитокинового профиля проявляют практикующие врачи.     В настоящий момент диагностическая значимость оценки уровня цитокинов заключается в констатации самого факта повышения или понижения их концентрации у данного больного с конкретным заболеванием. Причём для оценки тяжести и прогнозирования течения заболевания целесообразно определять концентрацию как противо-, так и провоспалительных цитокинов в динамике развития патологии. Например, содержание цитокинов в периферической крови определяется сроками обострения, отражает динамику патологического процесса при язвенной болезни и других заболеваниях желудочно-кишечного тракта. На самых ранних сроках обострения преобладает увеличение содержания интерлейкина-1бета (ИЛ-1бета), интерлейкина-8 (ИЛ-8), затем повышается концентрация интерлейкина-6 (ИЛ-6), гамма-интерферона (гамма-ИНФ), фактора некроза опухолей-альфа (альфа-ФНО). Концентрация интерлейкина-12 (ИЛ-12), гамма-ИНФ, альфа-ФНО достигала своего максимума в разгар заболевания, в то время как содержание маркёров острой фазы в этот период приближалось к нормальным величинам. На пике обострения уровень альфа-ФНО достоверно превышал содержание интерлейкина-4 (ИЛ-4) как в сыворотке крови, так и непосредственно в пораженной ткани околоязвенной зоны, после чего начинал постепенно уменьшаться. По мере стихания острофазных явлений, усиления процессов репарации возрастало увеличение концентрации ИЛ-4. По изменению цитокинового профиля можно судить об эффективности и целесообразности проводимой химиотерапии. При проведении цитокинотерапии, например при терапии альфа-интерфероном (альфа-ИНФ), необходимо контролировать как уровень его содержания в циркулирующей крови, так и наработку антител к альфа-ИНФ. Известно, что при наработке большого количества этих антител интерферонотерапия не только перестает быть эффективной, но и может привести к аутоиммунным заболеваниям. В последнее время разработаны и внедряются в практику новые препараты, так или иначе изменяющие цитокиновый статус организма. Например, для лечения ревматоидного артрита предлагается препарат на основе антител к альфа-ФНО, предназначенный для выведения альфа-ФНО, участвующего в деструкции соединительной ткани. Однако, как по нашим данным, так и по литературным, далеко не у всех больных хроническим ревматоидным артритом уровень альфа-ФНО повышен, поэтому для этой группы больных уменьшение уровня альфа-ФНО может ещё более усугубить дисбаланс иммунной системы. Таким образом, корректная цитокинотерапия предполагает контроль цитокинового статуса организма во время лечения. Защитная роль провоспалительных цитокинов проявляется локально, в очаге воспаления, однако их системная продукция не приводит к развитию противоинфекционного иммунитета и не препятствует развитию бактериально-токсического шока, что является причиной ранней летальности хирургических больных с гнойно-септическими осложнениями. Основой патогенеза хирургических инфекций является запуск цитокинового каскада, который включает, с одной стороны, провоспалительные, а с другой — противовоспалительные цитокины. Баланс между этими двумя оппозитными группами во многом определяет характер течения и исход гнойно-септических заболеваний. Однако определение концентрации в крови по одному цитокину из этих групп (например, альфа-ФНО или ИЛ-4) не будет адекватно отражать состояние всего цитокинового баланса. Поэтому необходима одномоментная оценка уровня нескольких медиаторов (по меньшей мере, 2–3 из оппозитных подгрупп). В ЗАО «Вектор-Бест» в настоящий момент разработаны и серийно производятся наборы реагентов для количественного определения: фактора некроза опухолей-альфа (чувствительность — 2 пг/мл, 0–250 пг/мл); гамма-интерферона (чувствительность — 5 пг/мл, 0–2000 пг/мл); интерлейкина-4 (чувствительность — 2 пг/мл, 0–400 пг/мл); интерлейкина-8 (чувствительность — 2 пг/мл, 0–250 пг/мл); рецепторного антагониста интерлейкина-1 (ИЛ-1РА) (чувствительность — 20 пг/мл, 0–2500 пг/мл); альфа-интерферона (чувствительность — 10 пг/мл, 0–1000 пг/мл); аутоиммунных антител к альфа-интерферону (чувствительность — 2 нг/мл, 0–500 нг/мл). Все наборы предназначены для определения концентрации указанных цитокинов в биологических жидкостях человека, в культуральных супернатантах при изучении способности культур клеток человека к продукции цитокинов in vitro. Принцип анализа — «sandwich»-вариант твердофазного трехстадийного (время инкубации — 4 ч) либо двухстадийного (время инкубации — 3,5 ч) иммуноферментного анализа на планшетах. Для анализа требуется 100 мкл биологической жидкости или культурального супернатанта на одну лунку. Учёт результатов — спектрофотометрически на длине волны 450 нм. Во всех наборах хромоген — тетраметилбензидин. Срок хранения наших наборов увеличен до 18 месяцев со дня выпуска и 1 месяца после начала использования. Анализ литературных данных показал, что содержание цитокинов в плазме крови здоровых людей, зависит как от наборов, используемых для их определения, так и от региона, где эти люди проживают. Поэтому для выяснения значений нормальных концентраций цитокинов у жителей нашего региона был проведён анализ случайных выборок плазмы (от 80 до 400 образцов) практически здоровых доноров крови, представителей различных социальных групп в возрасте от 18 до 60 лет без клинических проявлений грубой соматической патологии и отсутствием HBsAg, антител к ВИЧ, вирусам гепатитов B и C.

Фактор  некроза опухолей-альфа.

Альфа-ФНО —  это плейотропный провоспалительный  цитокин, состоящий из двух вытянутых b-цепей с молекулярной массой 17 кД и выполняющий регуляторные и  эффекторные функции в иммунном ответе и воспалении. Основные продуценты альфа-ФНО — моноциты и макрофаги. Этот цитокин выделяется также лимфоцитами  и гранулоцитами крови, естественными  киллерами, Т-лимфоцитарными клеточными линиями. Главные индукторы альфа-ФНО  — вирусы, микроорганизмы и продукты их метаболизма, в том числе бактериальный  липополисахарид. Кроме того, роль индукторов могут выполнять и некоторые  цитокины, такие как ИЛ-1, ИЛ-2, гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор, альфа- и бета-ИНФ. Основные направления биологической активности альфа-ФНО: проявляет избирательную цитотоксичность в отношении некоторых опухолевых клеток; активирует гранулоциты, макрофаги, эндотелиальные клетки, гепатоциты (продукция белков острой фазы), остеокласты и хондроциты (резорбция костной и хрящевой ткани), синтез других провоспалительных цитокинов; стимулирует пролиферацию и дифференцировку: нейтрофилов, фибробластов, эндотелиальных клеток (ангиогенез), гемопоэтических клеток, Т- и В-лимфоцитов; усиливает поступление нейтрофилов из костного мозга в кровь; обладает противоопухолевой и противовирусной активностью in vivo и in vitro; участвует не только в защитных реакциях, но и в процессах деструкции и репарации, сопутствующих воспалению; служит одним из медиаторов деструкции тканей, обычной при длительном, хроническом воспалении.

Рис. 1. Распределение  уровня альфа-ФНО

в плазме здоровых доноров.

Повышенный уровень  альфа-ФНО наблюдается в сыворотке  крови в период посттравматического состояния, при легочных дисфункциях , нарушениях нормального течения беременности, онкологических заболеваниях, бронхиальной астме. Уровень альфа-ФНО в 5–10 раз выше нормы наблюдается при обострении хронической формы вирусного гепатита С. В период обострения заболеваний желудочно-кишечного тракта концентрация альфа-ФНО в сыворотке превышает норму в среднем в 10 раз, а у отдельных больных — в 75–80 раз. Высокие концентрации альфа-ФНО обнаруживаются в цереброспинальной жидкости у больных рассеянным склерозом и цереброспинальным менингитом, а у больных ревматоидным артритом — в синовиальной жидкости. Это позволяет предполагать участие альфа-ФНО в патогенезе ряда аутоиммунных заболеваний. Частота выявления альфа-ФНО в сыворотке крови даже при тяжелом воспалении не превышает 50%, при индуцированной и спонтанной продукции — до 100%. Диапазон концентраций альфа-ФНО составил 0–6 пг/мл, среднее — 1,5 пг/мл (рис. 1).