Целлолюлитические ферменты

Для большинства мезофильных  продуцентов целлюлаз рекомендуется  на первой фазе роста культуры увеличивать  температуру на 3-5 °С выше оптимальной  для ускорения прорастания спор. Этот период в зависимости от продуцента имеет длительность от 14 до 20 ч. Далее температура снижается до оптимальной. Такой прием позволяет сократить длительность роста культуры на 10-12 ч. и повысить уровень активности культуры на 10-15%.

При твердофазном культивировании  длительность выращивания практически  для всех продуцентов лежит в  интервале от 2,5 до 3 суток и совпадает  с фазой интенсивного спорообразования. Выход культуры обычно составляет 76-78% по сухой массе от исходной среды и мало изменяется в последние сутки роста, так как легкодоступные источники углерода полностью утилизируются, а целлюлоза утилизируется очень медленно.

 

Получение препаратов целлюлаз из глубинных культур.

В настоящее время  во многих лабораториях нашей страны и за рубежом продолжаются работы по подбору условий и состава сред для глубинного культивирования продуцентов целлюлаз.

Отличительная особенность  большинства продуцентов целлюлаз – это большая длительность культивирования. Обычно максимум активности приходит на 4-8 сутки. Анализ данных показывает, что в культуральной жидкости при оптимальных условиях выращивания может накапливаться от 2 до 30 ед. АФБ/мл и от 200 до 800 ед. КМЦ/мл.

Разработана питетельная  среда (в %): карттоф. Крахмал – 1,56%; отруби пшеничные – 1,25%; (NH₄)₂SO₄ - 0,22%; K₃PO₄ – 0,14%; MgSO₄ -  0,014%;CaCl₂ – 0,014; пеногаситель – 0,001 (лапрол, пропинол); аммиачная вода (20%) – 0,6 (в пересчете на 100%) и вода до 100%. Усиление биосинтеза сопутствующих ферментов происходит при введении в среду соответствующих субстратов – крахмала, пектина, ксилана, ламинарина, лихеина, хитина.

С продуцентом Trichoderma viride возможны различные варианты промышленного культивирования, например:

- периодическая ферментация  на основе растворимого источника углерода или в присутствии целлюлозы или целлюлозосодержащего сырья;

- ферментация с подпиткой  на основе целлюлозы или целлюлозосодержащих  отходов;

- управляемая ферментация  с подпиткой, например, лактозой  на основе растворимых субстратов  в качестве единственного источника углерода или в комбинации с целлюлозосодержащими материалами в основной среде.

 

2.5. Выделение

 

На основе глубинной  культуры можно получить технические  препараты целлюлаз и очищенные  целлюлолитические препараты. Технические препараты получают путем высушивания распылением концентратов культуры без отделения твердой фазы или выпаривания ее жидкой фазы. Для снижения потерь при сушке в культуральную жидкость вводят стабилизаторы, чаще всего небольшие количества некоторых солей. Комплексные очищенные препараты из Trichoderma viride можно получить осаждением органическими растворителями и высаливанием сульфатом аммония.

На основе мутантного штамма Trichoderma viride разработан процесс получения комплексного целлюлазного препарата «Целловиридин». Технологическая схема состоит из следующих основных этапов:

- фильтрация культуральной  жидкости на фильтр-прессе на  капроновом или лавсановом полотне;

- высаливание, в качестве высаливающих агентов используют соли щелочных металлов и сульфат аммония;

- обессоливание проводят гель-фильтрацией (G25);

- тонкую очистку проводят  аффинной хроматографией;

- концентрируют вакуум – выпарной установкой;

- консервирование сублимационной сушкой.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Описание процессуально-технологической схемы получения целловиридина.

 

ВО1. Водоподготовка.

ВО2. Подготовка стерильного воздуха.

ВО3. Подготовка лабораторной культуры продуцента Trichoderma viride.

ТП1. Подготовка питательной  среды.

В состав питательной  среды входят следующие компоненты:

- картофельный крахмал (1,56%);

- пшеничные отруби (1,25%);

- (NH₄)₂SO₄  (0,22%);

- K₃PO₄ (0,14%);

- MgSO₄ (0,014%);

- CaCl₂ (0,014%);

- пропинол (0,001%);

- аммиачная вода 20% (0,6%);

- вода до 100%.

Все компоненты смешивают, затем стерилизуют при t = 135-137°С, Р = 1,5 атм в течении 1 ч. Выдерживают 1ч при t = 70-80°С, после чего охлаждают до  t = 40 ⁺_{_} 0,5°С.

ТП2. Подготовка посевного  материала.

Выращивание посевного  материала в лабораторных условиях происходит при t = 37°С, pH = 5,0 в течении 5 суток. Выращивание в промышленных условиях при тех же параметрах.

ТП3. Основная ферментация.

Происходит методом  глубинного культивирования при t = 37°С, pH = 5,0 в течении 5 суток.

ТП4. Получение культуральной  жидкости.

Культуральную жидкость получают фильтрацией при t = 37°С, pH = 5,0 в течении 5-8 мин.

 

ПО1. Биомасса продуцента и твердая взвесь среды.

ВО4. Дозирование (NH₄)₂SO₄.

ТП5. Разделение белков на фракции.

Для того чтобы разделить  белки на фракции используют метод  высаливания. Высаливание проводят с помощью (NH₄)₂SO₄, вследствие этого альбумины находятся в жидкой фракции, а глобулины выпадают в осадок.

ПО2. Отработанный (NH₄)₂SO₄.

ВО5. Подготовка сефадекса G25.

ТП6. Обессоливание.

Обессоливание проводят гель-фильтрацией, используя сефадекс G25 для удаления  (NH₄)₂SO₄. При этом сульфат аммония захватывается гелем, а белок переходит в раствор.

ПО3. Отработанный (NH₄)₂SO₄.

ВО6. Подготовка сорбента.

В качестве сорбента используют порошковую целлюлозу. Сорбент закупают в «Полицелл». Представляет собой порошок белого, серого или кремового цветов  марка ПЦС ТУ 5410-029-32957739-2004.

ВО7. Подготовка буфера.

Ацетатная буферная смесь pH = 4,5-5,5/

ТП7. Тонкая очистка.

Для тонкой очистки применяют  аффинную хроматографию. Ее проводят  с использованием в качестве сорбента порошковую целлюлозу в буферном растворе с pH = 4,5-5,5 в течение 1 ч.

ПО4. Регенерация сорбента.

ВО8. Подготовка градиента элюента.

Приготовление буферных растворов с pH = 6,0; 6,3; 6,5; 6,8; 7,0.

ТП8. Десорбция.

Десорбцию ферментов  проводят элюцией при pH = 6,5-7,0 с понижением ионной силой элюента до дистиллированной воды.

 

ТП9. Концентрирование.

Этап концентрирования проводим процессом вакуум-упаривания при t = 30-40°С в течение 2 мин.

ВО9. Подготовка хладагента.

В качестве хладагента применяется  фреон R13 с t_кип. = -80°С.

ТП10. Консервирование.

Консервирование происходит в сублимационной сушке при следующих  параметрах: t = -70 - -80°С, P = 0,001 атм в течение 10ч. Влажность препарата после сублимации составляет 0,5 %.

ПО5. Конденсат.

ТП11. Упаковка.

Упаковывают готовый высокоочищенный ферментный препарат «Целловиридин» в стеклянные флаконы объемом 5 мл.

 

 

 

 

                

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Заключение

 

Итак, ферментные препараты  повышают переваримость и усвояемость  питательных веществ кормов, устраняют  или снижают отрицательное влияние антипитательных веществ, в определённой степени восполняют дефицит пищеварительных ферментов в ранних стадиях развития молодняка с.-х. животных и птицы, когда выработка собственных ферментов затруднена, а также при кормлении животных кормами с высоким содержанием некрахмалистых полисахаридов. Благодаря действию ферментных препаратов фактическая питательность рациона возрастает на 5-8%, повышается продуктивность, снижаются расходы кормов на единицу продукции на 3-8% появляется возможность замены дорогих кормов (кукурузы, соевый шрот) на более дешёвые (рожь, ячмень, пшеничные отруби, подсолнечный жмых).

По мнению некоторых  учёных  использование кормовых ферментов обеспечивает такое же повышение обменной энергии рациона  как включение 2% кормового жира — можно подсчитать, что дешевле.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Список используемых источников:

 

1. Бирюков, В.В. Основы промышленной биотехнологии / В.В. Бирюков. - М. КолосС, 2004.
2. Варфоломеев С.Д., Гуревич К.Г. Биокинетика: практический курс. - М.: ФАЙР-ПРЕСС, 1999. - 720 с.
3. Грачева И.М., Кривова А.Ю. Технология ферментных препаратов. - 3-е изд., перераб. и доп. М.: Изд-во “Элевар” 2000. 512с. ил.
4. Грачева, И.М. Технология ферментных препаратов / И.М. Грачева. - М.: Агропромиздат, 1985.
5. Кислухина, О.В. Ферменты в производстве пищи и кормов / О.В.Кислухина. - М.: КолосС, 2002.
6. Манаков, М.Н. Теоретические основы промышленной биотехнологии / М.Н. Манаков, Д.Г. Победимский. - М.: Высшая школа, 1989. - 310 с.
7. Околекова Т.М. , Кулаков Н.В. и др. Корма и ферменты. -Сергиев Посад, 2001-112с.
8. Синицын А.П., Гусаков А.В., Черноглазов В.М. Биоконыерсия лигноцеллюлозных материалов: Учебное пособие. М.: издательство МГУ, 1995. – 125 с.

					Д.238.04.101.01.0000ПЗ	Лист
Изм.	Лист	№ докум.	Подп.	Дата

 

Изм	Лист	№ докум.	Подп.	Дата
Разраб.					Содержание	Лит.			Лист	Листов
Пров.						У			3
Н. контр.
Утв.