Исследование физико-химических свойств супромолекулярного комплекса хитозана

Исследование  физико-химических свойств супромолекулярного комплекса хитозана с некоторым  лекарственным препаратом.

     Целью первого этапа исследования было установление структурных и химических превращений, происходящих в хитозане при механообработке и механохимическом карбоксиметилирование,а также оценка молекулярно-массого распределения исходного и карбоксиметилированного хитозана .

Достижения поставленной цели требует решения следующих  задач:

1. Выделить хитозан из рачка Гаммарус и изучить его свойства; 
2. Провести механохимическую обработку исходного хитозана;
3. Провести реакцию карбоксиметилирования в условиях механохимического воздействия;
4. Оценить молекулярно-массовое распределение исходного и карбоксиметилированного хитозана.

     Полисахариды  обширный класс жизненно важных веществ, которые выполняют разнообразные  функции в живых организмах. Химическое строение их макромолекул (тип гликозидной  связи, моносахаридный состав цепи, наличие  функциональных групп) определяет их биологическое назначение [1] . Множество научных исследований в последние годы посвящено изучению совместимости полисахаридов с другими полимерами и друг с другом и созданию композиционных материалов на их основе. Такие материалы могли бы найти применение в качестве сорбентов и флокулянтов биологически активных веществ, трансурановых элементов, тяжелых металлов; как носители лекарственных средств; биоразлагаемые шовные материалы и пластики и т.д. [2]

     Хитин уникальный по свойствам и второй после целлюлозы по распространенности природный полисахарид. Однако до сих  пор хитин не получил должного широкого применения из-за раздробленности сырьевых ресурсов[1]. Он содержиться в грибах, членистоногих (Articulata). моллюсках (Mollusca),низших  растениях, червях. В грибах это один из основных компонентов клеточной стенки.  В членистоногих это основная часть экзоскелета. Хитин - основной компонент эпидермальной кутикулы костных рыб.[3]. Это  было  проверено двумя способами: 1) биохимическим тестом  хитина; 2) химической локализацией эндохитиназы области связывания на парафиновых срезах  грудных плавников рыб[4].

     Хитин -  поли[(1-4)-2-ацетамидо-2-дезокси-Д-глюкоза] -  широко распространенный  в  природе  и  возобновляемый  биополимер.

     В зависимости от расположения полимерных молекул различают три формы  структуры хитина - а, b и у. а-хитин  представляет собой плотно упакованный, наиболее кристаллический полимер, в котором цепочки располагаются  антипараллельно, он характеризуется самым стабильным состоянием. В b-хитине цепочки располагаются параллельно относительно друг друга, а в у-хитине две цепочки полимера "направлены

"вверх"  относительно одной, направленной "вниз", b- и у-хитины могут превращаться в а-хитин [5].

         Хитин  и  его  производные   благодаря  таким  своим   качествам,  как  биосовместимость  и биодеградируемость,  биологическая   активность  и  отсутствие  токсичности  и аллергенности,  способность  к  волокно-  и  пленкообразованию,  к   ионному  обмену  и комплексообразованию  широко используются в настоящее  время в медицинской, парфюмерной  и пищевой промышленности, сельском  хозяйстве и других областях. Традиционным источником получения  хитина являются панцири ракообразных, однако, основным  продуцентом   хитина  являются  мицелиальные  грибы[6].

       По  своим физико-химическим  характеристикам  хитин  грибов  значительно  отличается  от  хитина  ракообразных,  насекомых  и  гидробионтов,  поскольку в грибах он находится не в свободном состоянии, а связан  ионными  или  водородными  связями  с  полисахаридами,  липидами, белками и микроэлементами и выделение его в основном происходит в виде хитинглюканового комплекса (ХГК)[7].

     Простейшее  производное  хитина –  хитозан,  аминополисахарид 2-амино-2-дезокси-β-D-глюкан,  обраующийся при дезацитилировании хитина[8]. Хитозан – природный  аминополисахарид. Особенности  структуры  этого  полимера обуславливают ряд привлекательных свойств – биодеградируемость, ,биосовместимость, иммуномодулирующие  свойства[9]. Хитозан относительно недорогой, нетоксичный полимер . Для него описаны различные биологические свойства, например, антимикробная  и противоопухолевая активность, он способствует улучшению заживления ран[10].

         По химической структуре хитозан является сополимером D-глюкозамина и N-ацетил-D-глюкозамина. В зависимости от эффективности реакции деацетилирования получаются хитозаны с различным числом деацетилирования – от 50 до 90%. Хитозан нерастворимых в нейтральной и щелочной среде, но  растворим в неорганических и органических кислотах, в том числе глутаминовой кислоте, соляной кислоте, молочной кислоте и уксусной кислоте[11].

       Превосходная растворимость хитозана делает его более доступным к преобразованиям, чем хитин. Он может быть переработан в различные полезные формы, такие как гели, мембраны, губки, пленки, путем контроля факторов, таких как кислотность растворителя, степень дезацетилирования и молекулярный вес[12].

       Хитозан по своей структуре близок к мукополисахаридам  клеточных оболочек и внеклеточного  вещества различных органов человека, таким как гилауроновая кислота, хондроитин, гепарин. Катионный характер, присутствие реакционноспособных гидроксильных и аминогрупп дают возможность использовать хитозан в фармации в качестве носителя лекарственных веществ[13,14].

       Одним из наиболее характерных свойств многих полимеров, в том числе хитозана, является их способность образовывать вязкие растворы, поэтому, хитозан может использоваться в качестве загустителей, стабилизаторов. Кроме того, вязкость хитозана зависит от степени дезацетилирования, молекулярной масса, концентрации, типа  
растворителя, рН раствора и преобладающей ионной силы, а также  
температуры[15].

     За  последние несколько лет хитозан  был широко оценен как потенциальное  связывающее вещество для лекарств, назначаемых орально в качестве таблетирующего агента. Проведенные исследования комплексов хитозана с различными лекарственными веществами (ЛВ) показали, что в присутствии биополимера улучшается непрерывное высвобождение (ЛВ), что позволяет обеспечить пролонгированность его действия[13].

     Известных и потенциальных применений хитина, хитозана и их производных по оценкам насчитывается более 200. Такой широкий спектр применения включает биомедицину, продукты питания, биотехнологию, сельское хозяйство и косметологию и многое другое[16].

     Исследования  последних лет свидетельствуют, что селективность и биологическая  активность в  сорбционных процессах хитина и хитозана  связана  с  источником  происхождения,  молекулярной  массой  и степенью чистоты полимеров.[17]

     Превращение хитина в хитозан основано на реакции  дезацетилирования хитина, т.е. полученным при удалении ацетильной группы из положения С2 в хитине в результате обработки его в жестких условиях раствором щелочи, что позволяет заместить ацетильные группы хитина аминогруппами:

     Хитозан впервые был получен в 1859 году профессором С. Роже, путем сплавления хитина с гидроксидом калия при температуре 180-190 С, при этой обработке происходит гидролиз хитиновой N-ацетильной группы и частичная деструкция по β-(1–4)-гликозидной связи.[18] Практически получаемые образцы хитозанов обычно имеют мол. массу порядка (1-5) х 10⁵ и могут различаться остаточным содержанием ацетильных групп[19].

     Известен  способ получения хитозана при комплексной  переработке ракообразных, при котором  панцирьсодержащие отходы криля  измельчают и подвергают электрохимической  обработке постоянным электрическим  током, силой 5 - 9,5 А, плотностью 0,089 - 0,17 А/см, напряжением 20 - 40 В в водном растворе NaOH с концентрацией 0,25 - 1,5%, при соотношении отходов и  раствора 1:2 - 1:3 в течение 20 - 40 мин, при  перемешивании. Реакционную смесь  разделяют на жидкую (гидролизат) и  твердую (хитин) фазы. Хитин промывают  водой, проводят деацетилирование в 50%-ном  растворе щелочи при температуре 95 - 110^oC, отделяют хитозан от жидкой фазы, промывают водой [20].

     Недостатком этого способа являются жесткие  температурные режимы получения  целевого продукта, снижающие его  качественные показатели.

     Существует  также способ получения хитозана из ракообразных, включающий приготовление  раствора щелочи, добавление хитина в  щелочной раствор при постоянном перемешивании, отличающийся тем, что  после растворения щелочи в воде с образованием 50%-ного раствора последний  охлаждают до комнатной температуры 18 - 22^oС, сухой хитин вносят в него небольшими порциями в соотношении хитин : раствор щелочи 1 : 10 - 15 до образования однородной суспензии и последнюю выдерживают при комнатной температуре при периодическом перемешивании в течение 5 - 20 суток[21].

     Недостатком этого способа является длительность проведения анализа, однако, с помощью него получаются довольно воспроизводимые результаты.

     В работе будет использован способ, который был впервые рассмотрен на грибах. Очищенные от механических примесей и промытые водопроводной водой грибы подвергают депротеинированию: 
грибы вешенки помещают в стеклянный сосуд, снабженный мешалкой и заливают 0,1 н. раствором NaOH, соблюдая модуль ванны 1:10. Обработку вешенки щелочью проводят в течение 4 ч при температуре 25^oC при постоянном перемешивании. По истечение времени сырье процеживают и отжимают, промывают дистиллированной водой до нейтральной среды

(pH =7).

       После этого осуществляют очистку от минеральных  компонентов сырья, используя 0,6 н. раствор  соляной кислоты, для чего депротеинированное сырье помещают в стеклянный цилиндр  и заливают раствором кислоты  и выдерживают в течение 4 ч  при м.в. 1:10. Затем отделяют раствор  от осадка фильтрованием и промывают  дистиллированной водой до pH 7. Полученный таким образом хитин обесцвечивают 3% раствором H₂O₂ в течение 3 ч, промывают дистиллированной водой, а затем этанолом до обесцвечивания и сушат при 25^oC.

     Следующим этапом получают хитозан. Сухой измельченный хитин засыпают в трехгорлую колбу из стекла "пирекс", снабженную мешалкой, обратным холодильником и барботером. В течение 10 мин пропускают азот (60 пузырьков в минуту). После этого в колбу приливают через фильтр 50% водный раствор NaOH, имеющий температуру 80^oC в соотношении по массе 1:10. Через 10 мин колбу опускают в нагретую масляную баню, где температура 120-130^oC поддерживалась терморегулятором в течение 1-2 ч. По истечении времени систему быстро охлаждают, содержимое колбы фильтруют и промывают дистиллированной водой до pH 7 по фенолфталеину. Для окончательной очистки полученный хитозан промывают этанолом и эфиром, сушат на воздухе. Выход хитозана по хитину составляет 82% от теоретически возможного[22].

     Следующим этапом работы является карбоксиметилирование  хитозана, заключающим обработку  исходного полимера едким натром и натриевой солью монохлоруксусной кислоты, указанные компоненты смешивают  в твердой фазе и подвергают сильному механохимическому воздействию  в мельнице в течении 5-20 минут  при комнатной температуре ,с  мольным соотношением компонентов 1:1:1. [23]

      По  мере замещения водорода в гидроксильных  группах хитозана на группу –CH₂COONa, образующийся эфир хитозана приобретает такие свойства, как растворимость в воде и способность образовывать вязкие растворы.

      При карбоксиметилировании хитозана монохлоруксусной кислотой (или ее натриевой солью) и  гидроксидом натрия происходит, кроме основной реакции, и побочная – реакция монохлорацетата натрия и гидроксида натрия с образованием гликолята натрия и хлорида натрия[24].

     Поэтому,полученные продукты необходимо промыть от непрореагировавших реагентов подкисленным раствором этанола (pH=5) и чистым этанолом до нейтральной среды по фенолфталеину.[23]

     Проблемы  получения достаточно быстрого и  точного анализа молекулярно-массового  распределения (ММР) полимерной матрицы растительного сырья и его составляющих интересны и важны с научной и технической  точек  зрения. Их решение позволит оптимизировать  процессы переработки растительного сырья,  его  компонентов  и  производных  для  получения  целевых  продуктов  с  прогнозируемым  и воспроизводимым комплексом потребительских свойств.

     В настоящее время существует множество различных методов для определения молекулярно-массового распределения полимеров, такие как, гельпроникающая хроматография, метод термохимической спектроскопии, метод скоростной седиментациии т.д., поэтому важно знать суть каждого из этих способов[25].

     Способ определения ММР методом гель-проникающей хроматографии высокого разрешения. В качестве растворителя и элюента использовали фосфатный буфер(0,05М, pH=2,7) с добавлением 0,5М нитрата натрия, концентрация образцов составляла 10мг/мл. Для хроматографического анализа использовалась система с рефрактометрическим детектором и система компьютерной регистрации; скорость потока составляла                1,0 мл/мин.[26]

     Применен  неразрушающий метод  исследования (без применения  растворителя),  основанный  на  принципе  пенетрационного  деформирования  материала  в переменном  во  времени  температурном  поле. Величина  термомеханического