Хроматография

Введение.     

Бурное развитие жидкостной хроматографии в последние 10 лет обусловлено, главным образом, интенсивной разработкой теоретических  основ и практическим использованием ее высокоэффективного варианта, а  также созданием и промышленным выпуском необходимых сорбентов  и аппаратуры.  

Отличительной особенностью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) является использование  сорбентов с размером зерен 3—10 мкм, что обеспечивает быстрый массоперенос при очень высокой эффективности  разделения.   

В настоящее  время ВЭЖХ по темпам развития вышла  на первое место среди инструментальных методов, обогнав даже газовую хроматографию. Важнейшее преимущество ВЭЖХ по сравнению  с газовой хроматографией — возможность  исследования практически любых  объектов без каких-либо ограничений  по их физико-химическим свойствам, например, по температурам кипения или молекулярной массе.

Сегодня ВЭЖХ представляет собой хорошо оформленный инструментальный метод, который широко применяют  в самых  различных областях науки и техники.  Особенно    велико его значение в таких важнейших областях, как биохимия, молекулярная биология, контроль загрязнений    окружающей    среды,а также в химической, нефтехимической, пищевой и фармацевтической промышленности.

поскольку необходимо учитывать целый ряд весьма специфических  требований, обусловленных следующими особенностями методики.

а.  Колонки для  ВЭЖХ  наполняют  носителем  с очень  малым диаметром частиц. В результате при таких объемных скоростях растворителя, которые необходимы для быстрого разделения пробы, на колонке создается высокое давление.

б.  Детекторы,    применяемые    в    ВЭЖХ,    чувствительны  к флуктуации потока  и давления элюента   (шумы).  Более того, при  применении   концентрационных    детекторов     необходима еще более высокая  стабильность объемной  скорости  элюента.

в.  Процесс хроматографического  разделения  сопровождается рядом антагонистических эффектов, так, например, диспергирование образца в подвижной фазе ведет к смешению разделяемых компонентов и снижает максимальную концентрацию вещества  в элюируемом пике   (в детекторе). Диспергирование наблюдается на всех участках системы от точки ввода пробы до детектора.

г.  Растворители,  выполняющие  роль  подвижной  фазы,  часто  способны  вызывать  коррозию  аппаратуры.  Это  в  первую очередь относится к растворителям, используемым в обращен-но-фазовой хроматографии, которая  предпочтительна  в биохимических приложениях ВЭЖХ.

Специфику ВЭЖХ как инструментальной методики необходимо учитывать в процессе разработки, создания и эксплуатации этих систем. Для создания коммерческих образцов хрома-тографических систем и их компонентов, достаточно надежных, простых и безопасных в работе с приемлемым соотношением между ценой и техническими характеристиками, потребовалось более десяти лет поисков и исследований. Наметившиеся в последнее время тенденции к уменьшению колонок (как длины, так и диаметра) заставляют предъявлять новые требования к инструментам.       
 
 
 
 

1.1. ЭФФЕКТИВНОСТЬ И СЕЛЕКТИВНОСТЬ

Хроматография — это метод разделения компонентов  смеси, основанный на различии в равновесном  распределении их между двумя' несмешивающимися фазами, одна из которых неподвижна, а другая подвижна. Компоненты образца движутся по колонке, когда они находятся в подвижной фазе, и остаются на месте, когда находятся в неподвижной фазе. Чем больше сродство компонента к неподвижной фазе и чем меньше — к подвижной, тем медленнее он движется по колонке и тем дольше в ней удерживается. За счет различия в сродстве компонентов смеси к неподвижной и подвижной фазам достигается основная цель хроматографии — разделение за приемлемый промежуток времени смеси на отдельные полосы (пики) компонентов по мере их продвижения по колонке с подвижной фазой.

Из этих общих  представлений ясно, что хроматографическое разделение возможно, только в том  случае, если компоненты образца, попадая  в колонку при вводе пробы, во-первых, будут растворены в подвижной  фазе и, во-вторых, будут взаимодействовать (удерживаться) с неподвижной фазой. Если при вводе пробы какие-то компоненты находятся не в виде раствора, они будут отфильтрованы и не будут участвовать в хроматографи-ческом процессе. Точно так же компоненты, не взаимодействующие с неподвижной фазой, пройдут через колонку с подвижной фазой, не разделяясь на компоненты.

Примем условие, что какие-то два компонента растворимы в подвижной фазе и взаимодействуют  с неподвижной фазой, т. е. хроиатографический процесс может протекать без  нарушений. В этом случае после прохождения смеси через колонку можно получить хроматограммы вида а, б или в (рис. 1.1). Эти хроматограммы иллюстрируют хроматографические разделения, отличающиеся эффективностью (а и б) при равной селективности и селективностью (б и в) при равной эффективности.

Эффективность колонки тем выше, чем уже пик  получается при том же времени  удерживания. Эффективность колонки  измеряется числом теоретических тарелок  (ЧТТ) N: чем выше эф-   
 

Рис. 1.2. Параметры  хрома-тографического пика и расчет числа теоретических тарелок:

t_R — время удерживания пика; h — высота пика; WJ/J — ширина пика на половине его высоты

Рис. 1.1. Вид хроматограммы  в зависимости от эффективности  и селективности колонки:

а — обычная селективность, пониженная эффективность (меньше теоретических тарелок); б — обычные селективность и эффективность; в — обычная эффективность, повышенная селективность (больше отношение времен удерживания компонентов)  

фективность, тем  больше ЧТТ, тем меньше расширение пика первоначально узкой полосы по мере прохождения ее через колонку, тем уже пик на выходе из колонки. ЧТТ характеризует число ступеней установления равновесия между подвижной и неподвижной фазами.

Зная число  теоретических тарелок, приходящееся на колонку, и длину колонки L (мкм), а также средний диаметр зерна сорбента d_c (мкм), легко получить значения высоты, эквивалентной теоретической тарелке (ВЭТТ), а также приведенной высоты, эквивалентной теоретической тарелке (ПВЭТТ):

ВЭТТ = L/N

ПВЭТТ =B3TT/d_c.

Имея значения ЧТТ, ВЭТТ и ПВЭТТ, можно легко  сравнивать эффективность колонок разных типов, разной длины, заполненных разными по природе и зернению сорбентами. Сравнивая ЧТТ двух колонок одной длины, сравнивают их эффективность. При сравнении ВЭТТ сравнивают колонки с сорбентами одинакового зернения, имеющими разную длину. Наконец, величина ПВЭТТ позволяет для двух любых колонок оценить качество сорбента, во-первых, и качество заполнения колонок, во-вторых, независимо от длины колонок, зернения сорбентами его природы.

Селективность колонки играет большую роль в  достижении хроматографического разделения.

Селективность колонки зависит от очень многих факторов, и искусство экспериментатора в большой мере определяется умением  воздействовать на селективность разделения. Для этого в руках хроматографиста находятся три очень важных фактора: выбор химической природы сорбента, выбор состава растворителя и его модификаторов и учет химической структуры и свойств разделяемых компонентов. Иногда заметное влияние на селективность оказывает изменение температуры колонки, меняющее коэффициенты распределения веществ между подвижной и неподвижной фазами.

При рассмотрении разделения двух компонентов на хроматограмме и его оценке важным параметром является разрешение R_s, которое связывает времена выхода и ширину пиков обоих разделяемых компонентов

Разрешение как  параметр, характеризующий разделение пиков, увеличивается по мере возрастания селективности, отражаемой ростом числителя, и роста эффективности, отражаемой снижением значения знаменателя из-за уменьшения ширины пиков. Поэтому быстрый прогресс жидкостной хроматографии привел к изменению понятия «жидкостная хроматография высокого давления» — оно было заменено на «жидкостную хроматографию высокого разрешения» (при этом сокращенная запись термина на английском языке сохранилась HPLC как наиболее правильно характеризующее направление развития современной жидкостной хроматографии).   

Таким образом, размывание в колонке уменьшается  и эффективность повышается, когда используют более мелкий сорбент, более равномерный по составу (узкая фракция), более плотно и равномерно упакованный в колонке, при использовании более тонких слоев привитой фазы, менее вязких растворителей и оптимальных скоростей потока.

Однако наряду с размыванием полосы хроматографической зоны в процессе разделения в колонке  может происходить также и размывание ее в устройстве для ввода пробы, в соединительных капиллярах инжектор — колонка и колонка — детектор, в ячейке детектора и в некоторых вспомогательных устройствах (микрофильтры для улавливания механических частиц из пробы, устанавливаемые после инжектора, предколонки, реакторы-змеевики и др.)- Размывание при этом тем больше, чем больше внеколоночный объем по сравнению с удерживаемым объемом пика. Имеет также значение и то, в каком месте находится мертвый объем: чем уже хроматографическая зова, тем большее размывание даст мертвый объем. Поэтому особое внимание следует уделять конструированию той части хроматографа, где хроматографическая зона наиболее узкая (инжектор и устройства от инжектора до колонки) — здесь внеколоночное размывание наиболее опасно и сказывается наиболее сильно. Хотя считается, что в хорошо сконструированных хроматографах источники дополнительного внеколоночного размывания должны быть сведены до минимума, тем не менее каждый новый прибор, каждая переделка хроматографа должны обязательно заканчиваться тестированием на колонке и сравнением полученной хроматограммы с паспортной. Если наблюдается искажение пика, резкое снижение эффективности, следует тщательно проинспектировать вновь введенные в систему капилляры и другие устройства.

Размывание вне  колонки и его неправильная оценка могут привести к значительной (более 50%) потере эффективности, особенно в  тех случаях, когда относительно давно сконструированные хроматографы пытаются использовать для высокоскоростной ВЭЖХ, микроколоночной ВЭЖХ и других вариантов современной ВЭЖХ, требующих микроинжекторов, соединительных капилляров с внутренним диаметром 0,05—0,15 мм минимальной длины, колонок вместимостью 10—1000 мкл, детекторов с микрокюветами емкостью 0,03—1 мкл и с высоким быстродействием, высокоскоростных самописцев и интеграторов.  

1.2. УДЕРЖИВАНИЕ И  СИЛА РАСТВОРИТЕЛЯ   
 

Для того чтобы  анализируемые вещества разделялись  на колонке, как уже упоминалось выше, коэффициент емкости k' должен быть больше 0, т. е. вещества должны удерживаться неподвижной фазой, сорбентом. Однако коэффициент емкости не должен быть и слишком большим, чтобы получить приемлемое время элюирования. Если для данной смеси веществ выбрана неподвижная фаза, которая их удерживает, то дальнейшая работа по разработке методики анализа заключается в выборе такого растворителя, который обеспечил бы в идеальном случае различные для всех компонентов, но приемлемо не очень большие k'.Этого добиваются, меняя элюирующую силу растворителя.

В случае адсорбционной  хроматографии на силикагеле или  оксиде алюминия, как правило, силу двухкомпонентного растворителя (например, гексана с добавкой изопропанола) увеличивают, увеличивая в нем содержание полярного компонента (изопропанола), или же уменьшают, уменьшая содержание изопропанола. Если содержащие полярного компонента становится слишком малым (менее 0,1%), следует заменить его более слабым по элюирующей силе. Так же поступают, заменяя на другие либо полярную, либо неполярную составляющую и в том^ случае, если данная система не обеспечивает желаемой селективности по отношению к интересующим компонентам смеси. При подборе систем растворителей принимают во внимание как растворимости компонентов смеси, так и элюотропнЬе ряды растворителей, составленные разными авторами.

Примерно так  же подбирают силу растворителя в  случае использования привитых полярных фаз (нитрил, амино, диол, нитро и др.), учитывая возможные химические реакции и исключая опасные для фазы растворители (например и кетоны для аминофазы).

В случае обращенно-фазной хроматографии силу растворителя увеличивают, повышая содержание в элюенте органической составляющей (метанола, ацетонитрила или ТГФ) и уменьшают, добавляя больше воды. Если не удается добиться желаемой селективности, используют другую органическую составляющую либо пытаются изменить ее с помощью разных добавок (кислот, ион-парных реагентов и др.).

При разделениях  методом ионообменной хроматографии  силу растворителя меняют, увеличивая или уменьшая концентрацию буферного раствора или меняя рН, в некоторых случаях используют модификацию органическими веществами.

Однако, особенно в случае сложных природных и  биологических смесей, зачастую не удается подобрать силу растворителя таким образом, чтобы все компоненты пробы элюирова-лись за приемлемый срок. Тогда приходится прибегать к градиентному элюированию, т. е. использовать растворитель, элюи-рующая сила которого в процессе анализа изменяется так, что она постоянно увеличивается по заранее заданной программе. Таким приемом удается добиться элюирования всех компонентов сложных смесей за относительно короткий промежуток времени и их разделения на компоненты в виде узких пиков.