Днк и нуклеиновые кислоты

     При этом S-форма пневмококков была вирулентной, а R-форма не вызывала заболевания. Если пересевать микробы из капсульных колоний  на новый агар, то вырастали только капсульные формы, из бескапсульных  колоний вырастали только бескапсульные формы. Отсюда ясно, что способность иметь капсулу – наследственно закрепленное свойство пневмококков. Открытие Гриффитса состояло в том, что прибавление к бескапсульным формам бактерий экстракта из капсульных форм вызывало трансформацию (превращение): R-формы пневмококков превращались в S-формы. Гриффитсу удалось произвести трансформацию пневмококков и in vivo. Он вводил мышам небольшое количество живых R-форм и большие дозы S-форм, убитых нагреванием. В результате мыши погибали, причем из погибших животных удалось выделить жизнеспособные S-формы пневмококков. Таким образом, стало ясно, что от одного штамма бактерий к другому возможна передача наследственного начала, однако химическая природа его не была обнаружена. Сам Гриффитс ошибочно полагал, что это чистый полисахарид пневмококка, входящий в капсулу S-формы.

     Эвери и сотрудники поставили перед  собой задачу выяснить химическую природу  трансформирующего агента. Они разрушали суспензию пневмококков дезоксихолатом и удаляли из экстракта белки, капсульный полисахарид и РНК, однако трансформирующая активность экстракта сохранялась. Активную субстанцию можно было несколько раз переосаждать спиртом. Это вещество было идентифицировано Эвери по цветной реакции как ДНК. Трансформирующая активность препарата не терялась при его обработке кристаллическим трипсином или химотрипсином, панкреатической рибонуклеазой. Было ясно, что препарат не являлся ни белком, ни РНК. Однако трансформирующая активность препарата полностью утрачивалась при обработке его панкреатической дезоксирибонуклеазой, причем ничтожные количества фермента вызывали полную инактивацию препарата. Таким образом, было установлен но, что трансформирующий фактор у бактерий является чистой ДНК. Этот вывод явился значительным открытием, и Эвери отлично сознавал это. Он писал, что это как раз то, о чем давно мечтали генетики, а именно вещество гена. Опыты Эвери показали, кроме того, что различные штаммы бактерий даже одного вида различаются по своей ДНК. Впоследствии многочисленные эксперименты подтвердили опыты Эвери, но и оппозиция, не желавшая признавать ДНК веществом гена, была очень сильна. Полагали, что трансформацию могут вызывать и те ничтожные примеси белка, которые оставались в препарате. Новым доказательством прямой генетической роли ДНК явились опыты вирусологов Херши и Чейз. Им удалось включить в состав ДНК и белка бактериофага Т2, который заражает бактерию Escherichia coli (кишечную палочку), радиоактивные изотопы фосфора и серы. При этом ДНК фага метилась Р, а белок фага – S. Используя такой фаг с двойной меткой, они показали, что при фаговом заражении клеток Е. coli внутрь бактериальной клетки проникает в основном только фаговая ДНК и лишь ничтожное количество белка фага. Основная масса вирусного белка остается снаружи бактериальной клетки. Эта ДНК фага Т2 затем обеспечивает синтез себя самой, а также синтез белков фага Т2 в больших количествах внутри клетки-хозяина. Из полученных ДНК и белков вновь собираются характерные фаговые частицы.

     Открытие  Эвери того факта, что бактериальная  ДНК является фундаментальным принципом  трансформации бактерий, оказало  влияние на биологов и биохимиков послевоенного времени. В числе последних был биохимик Э. Чаргафф. В статье, посвященной столетию со времени открытия нуклеиновых кислот, он писал, что ни на одного исследователя выводы Эвери не оказали большего влияния, чем на него. Из темноты перед ним начали вырисовываться контуры грамматики в биологии. Чаргафф считал, что Эвери дал современникам первый текст нового языка, вернее, показал им, где искать этот язык. В лаборатории биохимии Колумбийского университета в Нью-Йорке Чаргафф решил начать поиски нового языка. Он начал с идеи о том, что если различные виды ДНК проявляют различную биологическую активность, то тогда обязательно должны существовать различия и в химическом составе нуклеиновых кислот. По аналогии с идеями и данными химии белка Чаргафф принялся искать разницу в нуклеотидном составе и расположении нуклеотидов в препаратах ДНК, полученных из различных источников. Методы, позволяющие точно дать химическую характеристику ДНК, в то время отсутствовали. Такие методы были развиты Чаргаффом, и они дали удивительные результаты. Оказалось, что старая тетрануклеотидная теория строения нуклеиновых кислот неверна. Существует на самом деле огромное количество различных ДНК, отличающихся по составу и расположению оснований и характеризующих данный вид. При этом обнаружились новые факты, не установленные ранее для других природных полимеров, а именно регулярности в соотношении отдельных оснований в составе всех исследованных ДНК. Хотя разные ДНК и различались значительно по своему нуклеотидному составу, все они подчинялись определенным общим правилам. Поразительным оказалось то, что в каждом образце ДНК число молекул аденина было равно числу молекул тимина, а гуанина – молекул цитозина.  

     Правила Чаргаффа

     Первое  правило Чаргаффа: А/Т = Г/Ц = 1.

     (Здесь  А, Т, Г и Ц соответствуют  молярным процентам соответствующих  азотистых оснований, приходящимся  на 100 грамм-атомов фосфора ДНК.  В ряде образцов ДНК, кроме  цитозина, обнаруживается 5-метилцитозин, который при подсчетах включают  в цитозин. В ДНК, выделенных  из бактериофагов (вирусов) Т2, Т4 и Т6, вместо цитозина имеется  5-гидроксиметилцитозин. Он встречается и в других вирусах.)

     Второе  правило Чаргаффа: А+Г=Ц+Т, т. е. количество пуринов в ДНК равно количеству пиримидинов.

     Третье  правило Чаргаффа: A+Ц=Г+T, т. е. количество оснований с аминогруппами в положении 6 равно количеству оснований с 6-кетогруппами.   

     Чаргафф не смог полностью объяснить своих  правил, основанных на результатах тщательной аналитической работы с различными образцами ДНК. Однако уже в 1953 г. это сделали молодые ученые Джеймс Уотсон и Фрэнсис Крик. Они создали структурную модель молекулы ДНК, которая полностью соответствовала ограничениям в нуклеотидном составе ДНК согласно правилам Чаргаффа.

     История этого открытия, ставшего крупнейшим событием в естествознании XX в., очень  живо и интересно рассказана одним из авторов новой структурной модели молекулы ДНК в книге «Двойная спираль». Молодые и безвестные ученые встретились впервые в 1951 г. в Кембридже (Англия), куда Уотсон был направлен из Чикаго для усовершенствования в научных исследованиях. Крик работал в Кавендишской лаборатории Кембриджского университета и занимался изучением пространственной структуры белковых молекул. В лаборатории в основном применялся метод дифракции рентгеновских лучей на кристаллах белков. Уотсон заинтересовался ДНК еще до приезда в Англию. В США Уотсон занимался проблемами генетики и биологии бактериофагов (вирусов бактерий). После опытов Эвери он был уверен, что наследственность фагов заключена в фаговой ДНК. Так как ДНК к этому времени была обнаружена в хромосомах всех клеток, то можно было предположить, что ДНК составляет вещество генов. Именно поэтому, попав в лабораторию, пользующуюся рентгеновскими методами, Уотсон решил заняться структурой ДНК. Как биолог, он понимал, что при выборе определенной структуры ДНК нужно учитывать существование какого-то простого принципа удвоения молекулы ДНК, заложенного в ее структуре. Ибо важнейшим свойством генов является их способность к удвоению и передаче идентичных наследственных свойств в ряду поколений от предков к потомкам.

     Интерес Уотсона к структуре ДНК разделил Крик, который также понимал огромную важность расшифровки наследственного материала. Значительное влияние на работу ученых оказал метод построения молекулярных моделей веществ с учетом всех валентных углов, межатомных расстояний и отбором наиболее  вероятных конфигураций атомных группировок. В 1952 году Лайнусу Полингу, используя этот метод, удалось расшифровать пространственную структуру полипептидной цепи, предложив для нее спиральную конформацию (α –спираль Полинга-Кори). Криком была создана теория дифракции рентгеновских лучей на спиралях, позволяющая определить, находится исследуемая структура в спиральной конформации или нет. В то время рентгенограммы ДНК уже существовали. Их получили в Лондоне Морис Уилкинс и Розалинд Фрэнклин. При этом оказалось, что ДНК может давать два типа структур в зависимости от содержания воды в препарате. При значительной гидратации ДНК находится в так называемой В-форме, которая переходит в кристаллическую А-форму при потере воды.

     По  характеру рентгенограммы В-формы  ДНК Уотсон и Крик поняли, что  исследуемая структура находится  в спиральной конформации. Они знали также, что молекула ДНК представляет собой длинную линейную полимерную цепь, состоящую из мономеров-нуклеотидов. Фосфодезоксирибозный костяк этого полимера непрерывен, а сбоку к дезоксирибозным остаткам присоединены азотистые основания. Для построения моделей оставалось решить вопрос, сколько цепей линейного полимера уложено в компактную структуру.

     На  основании рентгенограммы В-формы  ДНК Уотсон и Крик предположили, что молекула ДНК состоит из двух линейных полинуклеотидных цепей с  фосфодезоксирибозным остовом снаружи  молекулы и азотистыми основаниями  внутри ее. На рентгенограмме меридиональный рефлекс, соответствующий 3,4 Å, был гораздо  интенсивнее остальных. Это могло  означать, что пуриновые и пиримидиновые  основания толщиной 3,4 Å уложены плоскостями друг на друга перпендикулярно оси спирали. Кроме того, все данные рентгеноструктурного метода и электронной микроскопии говорили о том, что диаметр спирали равен примерно 20 Å. Оставалось также решить вопрос о порядке расположения азотистых оснований двух цепей внутри биспирали,

     Уотсон  предположил сначала, что пары азотистых  основании (по одному от каждой цепи) образуются по принципу «подобное взаимодействует с подобным». Он считал, что в двух линейных цепях молекулы ДНК аденин расположен на уровне аденина, гуанин – на уровне гуанина и т. д. Таким образом, две линейные полинуклеотидные цепи в молекуле ДНК совершенно идентичны и по составу азотистых оснований и по их последовательности. Была сделана попытка построить модель структуры ДНК, исходя из этого предположения. Однако пурины меньше пиримидинов, и на модели биспирали наблюдались то вспучивания, то сжатия.

     Рассматривая  другие возможные комбинации пар  азотистых оснований, Уотсон обнаружил, что пары аденин–тимин и гуанин–цитозин имеют одинаковый размер и стабилизируются водородными связями. Гуанин и тимин при этом должны были находиться в кетоформе, а не в таутомерной энольной форме. При физиологических рН кетоформы гуанина и тимина более устойчивы и переходят в энольную форму в щелочной среде. Сразу же объяснялись и правила Чаргаффа: если в биспирали ДНК аденин одной цепи всегда соединяется с тимином другой цепи, а гуанин всегда входит в паре с цитозином, то аденина в составе ДНК должно быть всегда столько же, сколько тимина, а гуанина – столько же, сколько цитозина. Ясно было также, как должно происходить удвоение молекулы ДНК. Каждая цепь комплементарна другой, и в процессе репликации ДНК цепи биспирали должны разойтись и на каждой полинуклеотидной цепи должна достроиться комплементарная к ней цепь.

     Оставалось  лишь построить точную модель подобной структуры с учетом всех требований рентгенографии и законов стереохимии, что ученые и сделали. Они построили  остроумную модель и убедились, что  все межатомные расстояния и валентные углы подошли. Таким образом, не оставалось сомнения в том, что, созданная ими структурная модель ДНК соответствует законам стереохимии. Рентгеноструктурные данные подтверждали наличие такой структуры. Чрезвычайно заманчивые перспективы открывались и в объяснении биологических явлений. Так,  репликацию ДНК можно было представить в свете новой модели как расхождение цепей родительской ДНК и надстройку на них комплементарных цепей. Результатом явились две новые идентичные молекулы ДНК, в каждой из которых одна цепь была родительской, а другая – вновь синтезированной (так называемый полуконсервативный способ репликации).

     Модель  Уотсона–Крика получила широкое  распространение и в настоящее  время подтверждена экспериментом. Итак, в соответствии с этой моделью  молекула нативной ДНК состоит из двух линейных полинуклеотидных цепей, спирально закрученных вокруг общей  оси и соединенных друг с другом межну-клеотидными водородными связями. Обе цепочки образуют правозакрученные спирали, но эти спирали являются антипараллельными по отношению  к оси биспирали, т. е. порядок  расположения атомов в их фосфатно-углеводных остовах имеет противоположное направление. Пентозофосфатные остовы каждой спирали находятся с внешней стороны молекулы, а пуриновые и пиримидиновые основания расположены в виде стопки внутри молекулы и связаны друг с другом водородными связями. При этом в молекуле ДНК возможно существование только двух комплементарных пар. Плоскости пар азотистых оснований перпендикулярны к оси биспирали. Межнуклеотидные расстояния по оси всюду равны и составляют 3,4 Å. Диаметр биспирали по всей длине одинаковый и составляет 18–20 Å.