Днк и нуклеиновые кислоты

     (Термин  «пурин» ввел в науку Фишер  от слов «purum» и «uricum». Термин «пиримидин» является комбинацией слов «пиридин» и «амидин». Кроме этих соединений, в гидролизате всегда находилось большое количество неорганической фосфорной кислоты и какого-то углевода.)

     Азотистые пуриновые основания имели структуру, близкую к структуре известной  мочевой кислоты, постоянно содержащейся в моче. Ее содержание в моче резко уменьшается при подагре вследствие того, что мочевая кислота откладывается в суставах. Основное значение своих открытий Коссель видел как раз в установлении связи между аденином и гуанином нуклеиновых кислот и мочевой кислотой. Он был первым ученым, получившим за работы в области нуклеиновых кислот Нобелевскую премию. В официальном документе, формулирующем основания для присуждения премии, было написано, что открытие в нуклеиновых кислотах аденина и гуанина объясняет происхождение нормального продукта обмена, выделяющегося через почки, – мочевой кислоты. Теперь мы хорошо понимаем, что установление связи между нуклеином и подагрой – дело нужное, однако оно не может конкурировать с ролью нуклеиновых кислот в передаче наследственных свойств клетки.

     Результаты  исследований Косселя и увенчание  их премией способствовали распространению  сведений о нуклеиновых кислотах среди врачебных кругов. Практическим выводом для медицины из этих работ явилась рекомендация для больного подагрой употреблять в пищу меньше тех продуктов, которые содержат много ядер и, следовательно, много нуклеина. Во все времена общество относится недоброжелательно к исследованиям, носящим чисто отвлеченный, оторванный от практики характер, и проявляет восхищение, когда в теоретических изысканиях обнаруживается какой-то практический смысл.

     Кроме идентификации некоторых продуктов  гидролитического расщепления нуклеиновой  кислоты, важная заслуга Косселя  состоит в открытии белка со щелочными  свойствами в ядрах клеток разных тканей. Выше уже говорилось о протамине, обнаруженном Мишером в молоках рыб, и о том, что, по его предположению, нуклеиновая кислота находится в ядрах в солеобразном соединении с протамином. В сперме быка, а также в незрелой сперме лосося Мишер не смог обнаружить протамина. Белки, выделенные Косселем из ядер многих тканей, играли, по-видимому, ту же роль, что и протамин. Ученый предложил для обнаруженного им белка название «гистон» (от «histos» — ткань, греч.).

     В лаборатории Косселя нуклеиновые  кислоты научились выделять из многих источников. В больших количествах, необходимых при лабораторной практике того времени, их легко получали из зобной железы (тимуса) теленка и из дрожжей. Было установлено, что эти кислоты отличаются друг от друга по пиримидиновому основанию. Нуклеиновая кислота зобной железы теленка – тимонуклеиновая кислота – содержала тимин, а дрожжевая нуклеиновая кислота – урацил вместо тимина. Поскольку тимонуклеиновая кислота была выделена из животных клеток, распространилось убеждение, что она характерна для объектов животного происхождения, в то время как дрожжевая нуклеиновая кислота — для объектов растительного происхождения. Таким образом, возникло представление о химическом различии в составе ядерного материала растительной и животной клеток. Эта точка зрения впоследствии оказалась неверной.

     Дальнейшее  исследование состава и структуры  нуклеиновых кислот проводилось  в лаборатории уроженца России Петра  Левена в США и в ряде других лабораторий. Первые работы Левена и  сотрудников были посвящены изучению состава и строения углеводного  компонента нуклеиновой кислоты. Сначала  был выделен в кристаллическом виде углеводный компонент дрожжевой нуклеиновой кислоты. Он оказался моносахаридом необычного строения – пентозой, которую назвали D-рибозой. Этот сахар был неизвестен к тому времени химикам, он встречался только в нуклеиновой кислоте. Впоследствии L-рибоза, а затем и D-рибоза были синтезированы Фишером и другими исследователями, а затем и закристаллизованы. Эта синтетическая кристаллическая D-рибоза оказалась химически тождественной сахару, выделенному из дрожжевой нуклеиновой кислоты.

     Выделить  углеводный компонент тимонуклеиновой  кислоты оказалось сложной задачей. Левен решил ее, используя мягкий ферментативный метод деградации тимонуклеиновой  кислоты сначала на большие фрагменты, затем из них умеренным гидролизом получали дезоксирибозу в кристаллическом виде. 2-Дезокси-О-рибоза была также получена синтетическим путем, и оказалось, что эта последняя идентична природной 2-дезокси-D-рибозе. Никаких других простых моносахаров в нуклеиновых кислотах не было найдено, хотя исследовались сотни препаратов из самых различных источников.

     После идентификации рибозы и дезоксирибозы  нуклеиновые кислоты получили новые  названия. Те, которые содержали  рибозу, стали называть рибонуклеиновыми кислотами или, сокращенно, РНК, а те, которые содержали дезоксирибозу, стали называть дезоксирибонуклеиновыми кислотами, или ДНК.

     Итак, после идентификации углеводного  компонента все низкомолекулярные  вещества, входящие в состав нуклеиновых  кислот, стали известными, и естественно возник вопрос, как они соединены между собой в молекуле природной нуклеиновой кислоты.

     Для изучения этой проблемы, следуя примеру  Фишера, Левен проводил гидролиз ДНК  не грубым многочасовым кипячением сильно подкисленных растворов, а в более мягких условиях – при уменьшении концентрации кислоты или при сокращении времени гидролиза. Еще более удачные результаты были получены при гидролизе ДНК с помощью ферментов. В то время еще не были выделены гомогенные препараты ферментов, разлагающих нуклеиновые кислоты, или нуклеазы. В качестве ферментов Левен брал фракцию желудочного сока животного. Нуклеазы работали в слабощелочной или нейтральной среде, т. е. в особенно мягких условиях. Теперь из гидролизатов удавалось выделить не только отдельные аденин, гуанин, тимин, цитозин, дезоксирибозу и фосфорную кислоту, но и более крупные фрагменты, например соединения азотистых оснований с углеводом или углевода с фосфорной кислотой. Вместе с тем в гидролизатах нуклеиновых кислот никогда не были обнаружены соединения, состоящие из двух азотистых оснований, или соединения типа основание – фосфорная кислота. Соединения азотистых оснований с углеводом было предложено называть нуклеозидами.

     При исследовании структуры рибо- и дезоксирибонуклеозидов было обнаружено, что они являются β-D-рибофуранозидами и 2-0-дезоксирибофуранозидами. Присоединение сахара к азотистому основанию происходит в положении 9 пуринов и в положении 3 пиримидинов.

     Выделение нуклеозидов и фосфорилированной  пентозы из гидролизатов нуклеиновых  кислот указывало, что в нуклеиновых кислотах азотистое соединение связано с пентозой, а последняя – с фосфорной кислотой. Действительно, Левену удалось выделить из гидролизатов РНК, полученных при действии, разбавленной щелочи, фосфорные эфиры нуклеозидов – адениловую, гуаниловую, уридиловую и цитидиловую кислоты. Фосфорные эфиры нуклеозидов назвали нуклеотидами. Как видно, нуклеотиды различаются между собой только характером азотистого основания. Поэтому их именуют по азотистому основанию. Положение фосфорного остатка нуклеотидов, полученных при действии разбавленной щелочи на РНК, может быть различным – он может находиться в положении 2', 3' или 5'. Из гидролизатов ДНК также удалось выделить фосфорные эфиры дезоксирибонуклеозидов, т. е. дезоксирибонуклеотиды. Пиримидиновые дезоксирибонуклеотиды получали мягким кислотным гидролизом ДНК, пуриновые дезоксирибонуклеотиды — при деградации ДНК с помощью ферментов. Работа по изучению структуры выделенных из ДНК и РНК нуклеозидов и нуклеотидов отняла у химиков много лет. Каждое соединение было закристаллизовано, идентифицировано, изучены его растворимость и химические свойства. В результате этих работ Левен пришел к выводу, что нуклеиновые кислоты являются полимерами. В качестве мономеров служат нуклеотиды. Содержание каждого из четырех нуклеотидов в ДНК или РНК, по данным химического анализа того времени, представлялось Левену равным. Поэтому Левен предложил следующую теорию строения нуклеиновых кислот: они являются полимерами, мономерами которых служат блоки из четырех нуклеотидов, соединенных последовательно.

     Что касается связей между нуклеотидами, то было предположено и рядом экспериментов подтверждено, что нуклеотиды соединяются между собой фосфодиэфирными связями.

     Остаток фосфорной кислоты образует фосфоэфирную связь в положении 3' одной пентозы  и 5' другой. При действии нуклеаз, получаемых в то время в неочищенном виде из различных источников, главным  образом из ядов змей и поджелудочной  железы животных, удалось выделить из гидролизатов нуклеиновых кислот как нуклеозид-6-фосфаты, так и  нуклеозид-3-фосфаты. Постепенно число  выделенных и очищенных нуклеаз  росло, и они стали главным  инструментом изучения связи нуклеотидов  в нуклеиновых кислотах. Браун  и Тодд использовали панкреатическую  рибонуклеазу, закристаллизованную  в 1940 г., для изучения структуры РНК  и подтвердили наличие в основном 3'–5'-фосфодиэфирных связей в РНК. Иногда в РНК наблюдались разветвленные  структуры, отличные от линейной цепочки, образованной связями. В этом случае предполагалось, что фосфоэфирная связь  образуется и в положении 2'. Что  касается ДНК, то там большинством методов  были обнаружены только 3'–5'-фосфодиэфирные связи между нуклеотидами. Разветвления в структуре ДНК почти отсутствовали. Из гидролизатов ДНК при действии панкреатической дезоксирибонуклеазы и диэстеразы змеиного яда Тодд и его сотрудники получали преимущественно (92%) дезоксирибонуклеозид-6-фосфаты, что свидетельствовало о   широком распространении 5'-фосфоэфирной связи с ДНК.

     Теория  тетрануклеотидного строения нуклеиновых  кислот казалась хорошо обоснованной. Она вошла во все учебники того (довоенного) времени как высшее достижение структурной химии нуклеиновых  кислот.  

     ПЕРВЫЕ  ДОКАЗАТЕЛЬСТВА БИОЛОГИЧЕСКОЙ  РОЛИ ДНК

     И УСТАНОВЛЕНИЕ СТРУКТУРЫ  ДНК

     Итак, в результате химических исследований создана первая теория строения нуклеиновых кислот. Было выяснено, что ДНК и РНК являются высокомолекулярными веществами. Наступил период, во время которого биологи, не отдавая себе ясного отчета относительно биологической роли нуклеиновых кислот, накапливали сведения об их распространении в различных типах животных и растительных тканей, в бактериях и вирусах, в некоторых одноклеточных организмах.

     Методом Фельгена было показано, что ДНК  находится не только в ядрах животных клеток, но и широко распространена в ядрах растительных клеток.

     В 1936 г. молодой советский ученый, ставший  впоследствии академиком, А. Н. Белозерский  впервые препаративно выделил ДНК  в чистом виде из растительного материала  – из ростков конского каштана.

     Работами  Браше, Дэвидсона и других исследователей в то же время было показано, что  РНК всегда встречается в животных клетках. Таким образом, оба вида нуклеиновых кислот оказались присущими как животным, так и растительным организмам.

     Генетика, сформировавшаяся в виде самостоятельной  науки в начале XX в., обобщила к  тому времени многие экспериментальные факты. Были вновь открыты и подтверждены законы Менделя. Была создана теория генов – элементарных единиц наследственности. Некоторыми учеными высказывались мнения о том, что наследственные свойства клеток связаны с каким-то ее материальным субстратом. Однако химическая природа генов оставалась загадкой. Большинство генетиков и биохимиков представляли гены в виде белков или комплексов белков с другими химическими соединениями, в частности с нуклеиновыми кислотами липидами или полисахаридами. Традиционное представление о первичной роли белков в жизненном процессе не позволяло и думать о том, что столь важное вещество, как вещество наследственности, могло быть чем-либо, кроме белка. Магия белка состояла еще и в сложности строения его молекул, их удивительном разнообразии. Известный советский генетик-цитолог Н. К. Кольцов подсчитал, что, варьируя последовательность 20 аминокислот, входящих в состав белковой молекулы, можно создать триллионы непохожих друг на друга белков. «Если бы мы, – писал Кольцов, – захотели напечатать в самой упрощенной форме, как печатаются логарифмические таблицы, этот триллион молекул и предоставили для выполнения этого плана все ныне существующие типографии мира, выпуская в год 50000 томов по 100 печатных листов, то до конца предпринятой работы протекло б столько времени, сколько его прошло с архейского периода д наших дней».

     А вот как пишет по этому поводу А. Р. Кизель – один из наиболее эрудированных  биохимиков, книга которого «Химия протоплазмы» была переведена на многие европейские языки: «Из только что  приведенных воззрений на роли нуклеиновой  кислоты... вытекает ее непричастность к строению генов и следует, что  гены составлены из какого-то другого  материала. Этого материала мы еще  достоверно не знаем, несмотря на то, что  он в большинстве случаев прямо  называется белком».

     Спустя 6 лет по этому вопросу совершенно в том же духе высказался известный  цитолог Б. В. Кедровский: «Белок и  ген с разных точек зрения являются центрами ядерной активности. Внутри соматической клетки гены оказываются  локализованными в хромосомах и  притом в тех участках их («хромомерах»), которые содержат нуклеопротеид, т. е. соединение гистона с нуклеиновой  кислотой. Таким образом, и результата цитологического анализа тесно  связывают гены с наиболее типичными  и постоянными ядерными белками. Поэтому естественно должна была зародиться мысль об их идентичности, т. е., другими словами, о белковой природе гена. Мысль эта в настоящее  время разделяется значительным числом исследователей. Затруднение создают протамины спермиев рыб, которые с этой точки зрения должны являться единственным субстратом факторов наследственности, но вместе с тем чересчур примитивны и однообразны для такой роли по своему химическому строению».

     И вот в этой традиционной области  науки один за другим начали появляться новые факты, и по словам академика  В. А. Энгельгардта: «В результате мощного  взаимного усиления тесно переплетающихся линий исследования в огромной степени возрос фронт аналитического изучения коренных явлений жизни... В короткий срок, на протяжении полутора-двух десятилетий возникла новая наука, молекулярная биология, которая и произвела подлинную революцию во многих важнейших областях биологии». Прогресс биологии оказался тесным образом связанным с усовершенствованием техники экспериментов, появлением электронных микроскопов, тонких методов разделения белков и нуклеиновых кислот, кристаллизацией ферментов, применением радиоактивных изотопов.

     Первый  успех пришел из микробиологии. В 1944 г. были опубликованы результаты опытов Эвери и сотрудников (США) по трансформации  бактерий. Явление трансформации  было открыто в 20-х годах нашего столетия микробиологом Гриффитсом (Англия). Гриффитс работал с пневмококками (бактериями, вызывающими пневмонию) и пытался понять природу их вирулентности. К тому времени пневмококки удалось разделить на ряд форм. Всего существовало несколько типов пневмококков, каждый из которых синтезировал специфический полисахарид клеточной оболочки — капсулы с характерными серологическими и химическими свойствами. В 1928г. Гриффитс обнаружил, что один штамм пневмококка, культивируемый в особых условиях in vitro, утратил способность к синтезу своего полисахарида и поэтому рос на твердой среде в виде так называемых складчатых колоний (R-формы), отличных от гладких, блестящих колоний клеток, имеющих капсулы (S-формы).