Поступление и превращение соединений азота в растениях

Разумное сельское хозяйство обязано  стремиться к тому же результату: пахотные почвы должны не терять плодородие, а увеличивать его. Запасы почвенного азота - важнейшее из условий плодородия. И у природы, и у человека стратегия  здесь едина: создание большого долговременного  резервного фонда. Но фонд - отнюдь не "замороженный капитал": какая-то часть его должна непрерывно и постепенно поступать  к растениям, и столь же непрерывно он должен пополняться за счет либо природных процессов, либо удобрений.

Отсюда - тактические задачи:

• ускорение оборота азота в системе почва - растение без нарушения основного резерва;
• предупреждение потерь азота;
• пополнение его запасов за счет удобрений.

Такая тактика обеспечит бездефицитный  баланс азота в земледелии - и  сегодня, и в будущем.

Особенности усвоения молекулярного  азота 

Биологическая фиксация азота атмосферы  имеет важное значение. Об этом свидетельствуют  масштабы процесса — до 200 млн т  N/год. Благодаря биологической фиксации азот переходит в формы, которые могут использовать все растительные, а через них и животные организмы.

Характеристика азотфиксаторов.

Организмы, способные к усвоению азота воздуха, можно разделить  на группы:

1) симбиотические азотфиксаторы  — микроорганизмы, которые усваивают  азот атмосферы, только находясь  в симбиозе с высшим растением;

2) не симбиотические азотфиксаторы  — микроорганизмы, свободно живущие  в почве и усваивающие азот  воздуха;

3) ассоциативные азотфиксаторы  — микроорганизмы, обитающие на  поверхности корневой системы  злаков, т. е. живущие в ассоциации  с высшими растениями.

Важное значение имеют симбиотические азотфиксаторы, живущие в клубеньках корней бобовых растений (клубеньковые бактерии), относящиеся к роду Rhizobium. Связывание азота атмосферы возможно только при симбиотической ассоциации микроорганизмов этого вида и высшего растения в основном из семейства Бобовые. Существует большое количество разновидностей (штаммов) клубеньковых бактерий, каждая из которых приспособлена к заражению одного или нескольких видов бобовых растений. Это отражается в их названиях: Rhizobium lupini — клубеньковые бактерии люпина и Rhizobium trifolii— клубеньковые бактерии клевера и т. д.

Корневые системы бобовых растений обладают специфическими корневыми  выделениями. Благодаря этому клубеньковые бактерии скапливаются вокруг корневых волосков, которые при этом скручиваются. Такая способность организмов передвигаться  в ответ на узнавание химических продуктов, называется хемотаксисом. В осуществлении контактного взаимодействия микроорганизмов с растением важное значение имеет так называемое лектину-глеводное узнавание растения микроорганизмом. Суть этого в том, что лектин корневых волосков растений прочно связывается с углеводом поверхности бактерий. Бактерии, внедрившиеся в корневой волосок, в виде сплошного тяжа (т. н. инфекционные нити), состоящего из соединенных слизью бесчисленных бактерий, проникают в паренхиму корня. Клетки перицикла начинают усиленно делиться. Возможно, бактерии выделяют гормональные вещества типа ауксина, и именно это является причиной разрастания тканей, образуются вздутия — клубеньки. Клетки клубеньков заполняются быстро размножающимися бактериями, но остаются живыми и сохраняют крупные ядра. Бактерии при этом трансформируются сами, увеличиваются в размерах, поэтому их называют бактероиды.

Клубеньковые бактерии заражают только полиплоидные клетки корня. Ткань клубеньков, заполненная бактериями, приобретает розовую окраску, так как после заражения в клетках бактерий образуется пигмент, сходный с гемоглобином, — леггемоглобин. Этот пигмент связывает кислород воздуха и тем самым предохраняет фермент нитрогеназу от воздействия кислорода. Исследования показали прямую зависимость между содержанием леггемоглобина и скоростью фиксации азота. При отсутствии леггемоглобина азот не усваивается. Информация об образовании леггемоглобина содержится в ДНК ядра клетки высшего растения. Синтезируется клетками растения-хозяина. Однако он образуется после их заражения. Гены растений, кодирующие образование клубеньков, носят название nod-GENE (нодулин-гены). Показано, что скопление бактерий вокруг корня вызывает выделение веществ (возможно олигосахаров), которые активируют т. н. нодулин-белок, индуцирующий транскрипцию нодулин-генов. Взаимоотношения между высшими растениями и клубеньковыми бактериями обычно характеризуют как симбиоз. Однако на первых этапах заражения бактерии питаются целиком за счет высшего растения, т. е. практически паразитируют на нем. В этот период рост зараженных растений даже несколько тормозится. В дальнейшем азотфиксирующая способность бактерий увеличивается, и они начинают снабжать азотистыми веществами растение-хозяина, вместе с тем бактерии получают от высшего растения углеводы (симбиоз). По мере дальнейшего развития наступает этап, когда высшее растение паразитирует на клетках бактерий, потребляя все образующиеся там азотистые соединения. В этот период часто наблюдается растворение (лизис) бактериальных клеток.

Благодаря деятельности клубеньковых бактерий часть азотистых соединений из корней бобовых растений диффундирует в почву, обогащая ее азотом. Посев  бобовых растений ведет к повышению  почвенного плодородия. Гектар бобовых  растений в симбиозе с бактериями может перевести в связанное  состояние от 100 до 400 кг азота за год. Значение этого трудно переоценить, если учесть, что азотные удобрения  наиболее дорогостоящи, а в почве  соединения азота содержатся в небольших  количествах. Существуют и другие виды высших растений, у которых наблюдается симбиоз с микроорганизмами. Так, маленький водный папоротник азолла (Azolla) находится в симбиотических отношениях с азотфиксирующими цианобактериями. Азолла способна фиксировать до 0,5 кг азота на га в сутки. Некоторые деревья и кустарники (например, ольха, облепиха, лох) имеют в качестве симбионтов бактерии из рода актиномицеты. Большое значение имеют свободноживущие бактерии — азотфиксаторы. В 1893 г. русским микробиологом С.Н. Виноградским была выделена анаэробная азотфиксирующая бактерия Clostridium pasteurianum. В 1901 г. голландский ученый М. Бейеринк выделил две аэробные азотфиксирующие бактерии — Azotobacter chroococum, Azotobacter agile. Сейчас известен ряд видов Azotobacter. Свободноживущие азотфиксаторы могут быть факультативными аэробными или факультативными анаэробными. Для того чтобы эти микроорганизмы осуществляли процесс фиксации азота, необходимо присутствие молибдена, железа и кальция. Особенно важно присутствие молибдена. Свободно живущие азотфиксаторы {Azotobacter) усваивают в среднем около 1 г азота на 1 м 2 в год. Усваивать атмосферный азот способны и многие другие бактерии: клебсиеллы, бациллы и т. д. Особый интерес представляют цианобактерии, вызывающие цветение пресных и океанических водоемов. В ряде стран их разведение практикуется на рисовых полях.

Ассоциативные азотфиксаторы были обнаружены в 70—80-х годах XX в. в лаборатории Д. Доберейнер в Бразилии (1976). Число их видов велико, как велико разнообразие ассоциативных взаимоотношений растений с микроорганизмами. Такие отношения характерны для ризосферных микроорганизмов, т. е. живущих на поверхности корневой системы растений. Часто микробиологи не делают различия между ассоциативными и свободноживущими азотфиксаторами. Последовательность взаимоотношений с растением-хозяином ассоциативных азотфиксаторов имеет определенное сходство с симбиотическими организмами: хемотаксическое узнавание, лектин-углеводное узнавание и этап установления прочных связей. Отсутствует только этап образования клубеньков. Эффективность азотфиксации ассоциативной микрофлорой меньше по сравнению с симбиотической, но ассоциативные азотфиксаторы продуцируют гормоны роста растений и обладают другими свойствами, положительно влияющими на рост и развитие растений (защита от фитопатогенов, разрушение токсических веществ). Наиболее изучены из этой группы микроорганизмы из рода азоспирилл (Azospirillum). Они колонизируют корни злаков и в связи с этим представляет интерес технология их выращивания. Азоспириллы легко инфицируют корневую систему злаков и других растений.

Химизм фиксации атмосферного азота.

Конечным продуктом фиксации азота является аммиак. В процессе восстановления азота до аммиака участвует мультиферментный комплекс — нитрогеназа. Нитрогеназа состоит из двух компонентов: MoFe-белок и Fe-белок. MoFe-белок молекулярной массой 200—250 КДа содержит молибден, железо и серу. По современным представлениям этот белок осуществляет связывание и восстановление азота. Fe-белок молекулярной массой 50—70 КДа содержит железо и серу. Эта субъединица участвует в транспорте электронов от их доноров (ферредоксин) на MoFe-белок.

Источником протонов и электронов для восстановления азота служит дыхательная электрон-транспортная цепь. Это указывает на связь усвоения азота атмосферы с процессами дыхания, а также фотосинтеза (источника  углеводов). Для восстановления N2 до NH3 требуется шесть электронов, согласно уравнению:

N2 + 6е + 2Н+ -> 2NH3

Процесс требует АТФ как источника  энергии: по расчетам для восстановления одной молекулы N2 требуется не менее 12 молекул АТФ. Реальные затраты энергии значительно выше и составляют 25—35 молекул АТФ. Нитрогеназа — фермент с низкой субстратной специфичностью, поскольку восстанавливает и другие соединения с тройной связью: цианиды, ацетилен, азиды и др. Особенность нитрогеназы заключается и в том, что для работы фермента требуются анаэробные условия. Вместе с тем в клетках высшего растения кислород необходим для поддержания дыхания. Роль леггемоглобина заключается в связывании 02 в организме бактерий и создании условий для работы нитрогеназы.

Для образования леггемоглобина необходимы Fe, Сu и Со. Для нормального протекания процесса азотофиксации необходимы Мо и Fe, поскольку они входят в состав фермента нитрогеназы. Молибден выполняет структурную функцию, поддерживая конформацию нитрогеназы, каталитическую, участвуя в связывании азота и переносе электронов, а также индуцирует синтез нитрогеназы. Кобальт необходим в связи с тем, что он входит в состав витамина В12, который вовлекается в процесс биосинтеза леггемоглобина. Образовавшийся аммиак здесь же в клетках корня реагирует с а-кетоглутаровой кислотой с образованием глутаминовой кислоты, которая и вовлекается в дальнейший обмен. В надземные органы растения-хозяина азотистые вещества передвигаются главным образом в виде амидов (аспарагина, глутамина). Как уже отмечалось, фиксирование атмосферного азота может осуществляться и рядом свободноживущих фотосинтезирующих организмов (цианобактериями, серными бактериями). В этом случае донором протонов и электронов может быть или вода, или сероводород.

Открытие азотфиксаторов привело  к созданию бактериальных удобрений (нитрагин, ризотрофин, азотобактер  и др.). Эти удобрения содержат естественные почвенные организмы  и позволяют увеличить накопление биомассы высшими растениями. Перспективность  такой технологии в том, что она  позволяет частично заменить минеральные  удобрения, и таким образом снизить  уровень загрязнения, вызванный  их интенсивным использованием. Новые  перспективы для увеличения эффективности  азотфиксации и улучшения азотного питания растений открывает использование  достижении генной инженерии. Установлено, что фиксацию азота обеспечивают ферменты — продукты nif-генов. В настоящее время практически решена проблема увеличения дозы nif -генов у клубеньковых бактерий рода Rhizobium. Выполнены работы по переносу nif -генов в другие организмы, поскольку большинство этих генов локализуется на плазмидах. Имеются предпосылки к созданию методами генной инженерии злаковых растений-азотфиксаторов. Исследование основ азотфиксации открывает перспективы создания экономных и эффективных технологий фиксации азота воздуха. Технология синтеза аммиака в промышленности предполагает использование катализаторов, поддержание температуры около 500°С и давления 300—350 атм. В клетке этот процесс идет при нормальной температуре, низком давлении и без загрязнения среды обитания.

Питание азотом высших растений. Азотный обмен растений

Высшие растения поглощают соединения азота из почвы. Основным источником азотного питания для растений являются нитраты и аммиак. Изучение отдельных  этапов превращения азотистых соединений, а также исследования, показавшие широкое распространение процессов  реутилизации соединений азота, привели  к представлению о круговороте  азотистых веществ в растительном организме. Корневые системы растений хорошо усваивают нитраты, которые, поступая и корни растения, подвергаются ферментативному восстановлению до нитритов и далее до аммиака. Этот процесс происходит главным образом  в корнях, однако этой способностью обладают и клетки листьев. Восстановление нитратов до аммиака идет через ряд  этапов. На первом этапе нитраты  восстанавливаются до нитритов при  участии фермента нитратредуктазы:

N03- + 2е -> N02

Нитратредуктаза — это фермент  с молекулярной массой 200—270 КДа, содержащий в своем составе ФАД, гем и  молибден. Фермент локализован в  цитозоле, где и протекает процесс  восстановления нитратов до нитритов. Донором электронов при этой реакции  у грибов является НАДФН, а у растений НАДН. В свою очередь поставщиком  этих соединений являются процесс дыхания  и отчасти световые реакции фотосинтеза. Именно поэтому восстановление нитратов тесно связано с дыхательным  газообменом. Вместе с тем для  нормального протекания процесса дыхания  растение должно быть достаточно обеспечено углеводами. При искусственном снижении содержания углеводов (выдерживание растений в темноте) нитраты не восстанавливаются, а накапливаются во всех органах  растения. При усиленном поступлении  нитратов содержание углеводов падает. Интересно, что растения-нитратонакопители, например, некоторые среднеазиатские  солянки, содержат мало углеводов и  большое количество органических кислот. Показано, что нитратредуктаза относится  к индуцибельным ферментам. Ее новообразование  вызывается присутствием в среде  нитратов. Вместе с тем накопление продукта реакции — нитритов репрессирует образование нитратредуктазы. Интересно, что фитогормоны цитокинины также  индицируют синтез нитратредуктазы. На восстановление нитратов большое влияние  оказывает свет. Прежде всего, на свету  в процессе фотосинтеза образуются углеводы, необходимые для восстановления, а также для дальнейшего превращения нитратов. Вместе с тем для восстановления нитратов могут быть непосредственно использованы продукты, образующиеся в процессе нециклического фотофосфорилирования (НАДФН, АТФ). Свет влияет и на уровень фермента нитратредуктазы. Показано, что при низкой освещенности, дефиците Fe и Мо активность фермента снижается, и нитраты накапливаются в клетке. Восстановление нитратов стимулируется при освещении синим светом. Возможно, это связано с тем, что флавин, который входит в состав нитратредуктазы, поглощает синий свет и активируется им.

Второй этап — восстановление нитратов до аммиака катализируется ферментом  нитритредуктазой:

N02- + 6е -> NH4+

Нитритредуктаза — это фермент  с молекулярной массой 60—70 КДа содержит в качестве простетической группы гем. Активность этого фермента значительно  выше, чем нитратредуктазы. Нитритредуктаза  локализована в хлоропластах листьев  или пропластидах корней. Донором  электронов в листьях служит восстановленный  ферредоксин, который образуется при  функционировании на свету ФС I. Нитриты  образуются не только на промежуточной  стадии восстановления нитратов. Они, как и нитраты могут поступать  в растение из почвы. При этом нитриты  также подвергаются восстановлению до аммиака при участии нитритредуктазы. Однако нитриты при накоплении в  цитоплазме могут оказаться ядовитыми, поскольку фермент локализован  в хлоропластах. Передвижение нитритов в хлоропласты стимулируется  Са. При недостатке Са нитриты не восстанавливаются до аммиака и  накапливаются в клетках. Установлено, что в высших растениях, так же как у прокариот и грибов, наряду с восстановлением нитратов до аммиака  осуществляется и обратный процесс  — окисление аммонийной формы  азота в нитратную, что опровергает  широко распространенное мнение об исключительно  экзогенном происхождении нитратов в растениях (Б.А. Ягодин).