Культура тканей в цветоводстве

     · миниатюризация процесса, приводящая к экономии площадей, занятых маточными  и размножающимися растениями;

     · оздоровление растений от грибных и  бактериальных патогенов, вирусов, микоплазменных, вироидных и нематодных инфекций;

     · возможность размножения и укоренения растений, размножение которых затруднено обычными способами[25].  
 
 

     1.3 Оздоровление растений в культуре in vitro

     Применение биотехнологических методов в оздоровлении и селекции растений продуктивно и имеет перспективы развития. 
В селекционной работе при гибридизации зачастую образуются щуплые семена или семена, в которых зародыш гибнет на ранних стадиях развития. В таких случаях для получения новых сортов и форм активно используется метод изолированных зародышей и метод культуры семян in vitro[26].

     Основное  преимущество клонального микроразмножения — это получение генетически однородного, безвирусного посадочного материала. Этого возможно достичь, используя меристемные ткани апексов и пазушных почек органов стеблевого происхождения. Как правило, меристема состоит из конуса нарастания, а также одного или двух листовых зачатков (примордиев) и является свободной от инфекции.

     Предположение о возможности отсутствия вирусов  в меристематических тканях больных  растений впервые высказано Чунгом (1938) и П. Р. Уайтом (1943)[27]. Начиная с 50-х годов XX в. были предприняты первые успешные опыты по получению свободных от вирусов растений георгина из точки роста, а также свободные от вирусной инфекции растения орхидей (Cymbidium). Авторы этого метода Ж. Морель и С. Мартин полагали, что в больном растении вирус распространяется с отставанием от быстро растущих молодых органов, особенно в молодых недифференцированных тканях, где концентрация вируса может снижаться, вплоть до полного отсутствия[28]. Теоретические концепции, положенные в основу этого метода, стали проясняться в последнее время.

     Немаловажным  достоинством технологии микроклонального размножения является возможность  освобождения растений от грибных и  бактериальных патогенов, вирусов, микоплазменных, вироидных и нематодных инфекций за счет использования меристемной  культуры [28]. Таким образом, в связи  с возрастающими требованиями к  исходному посадочному материалу, который в соответствии с последними стандартами должен быть свободен от различных инфекций, биотехнологические методы приобретают лидирующую роль в получении высококачественной цветочной продукции [29].

     Структурной основой используемого на практике явления служит специфика строения точки роста растений; дистальная её часть, представленная апикальной меристемой, у разных растений имеет средний диаметр до 200 мкм и высоту от 20 до 150 мкм. В более нижних слоях дифференцирующиеся клетки меристемы образуют прокамбий, дающий начало пучкам проводящей системы. Известно, что успех клонального микроразмножения зависит от размера меристематического экспланта, чем больше листовых зачатков и тканей стебля, тем легче идет процесс морфогенеза, заканчивающийся получением целого, нормального пробирочного растения. Вместе с тем зона, свободная от вирусных частиц, очень различна для разных вирусов. Это зависит также от вида и сорта растения. В колеоптиле злаков, например, размеры участка верхушки, не содержащей сосуды, могут достигать до 250 мкм. Такая особенность строения апикальной меристемы исключает проникновение в неё вируса путем быстрого транспортирования по проводящей системе, но допускает возможность медленного распространения через плазмодезмы, соединяющие меристематические клетки.

     Применение электронной микроскопии часто обнаруживает наличие вирусов в меристеме пораженных ими растений, это, впрочем, подтверждает общеизвестный факт, что число лишенных вируса растений после подобной операции чрезвычайно мало, и многие меристемы пораженных растений инфекционны.

     Таким образом, эффективность применения апикальной меристемы в качестве метода оздоровления зараженных вирусами растений оказывается низкой. В принципе возможно получение безвирусной  апикальной меристемы от больного растения, но при этом риск попадания вирусов  в здоровые ткани должен быть снижен до нуля. Это может быть достигнуто путем применения предварительной термотерапии исходных растений или хемотерапии. Это было представлено результатами, полученными сотрудниками Никитского ботанического сада (Ялта), которые предложили биотехнологические системы освобождения растений от комплекса вирусов плодовых культур [30,31].

     Метод термотерапии применяется как в  условиях in vivo, так и in vitro и предусматривает использование сухого горячего воздуха. Для объяснения механизма освобождения растений от вирусов в процессе термотерапии существуют различные гипотезы. Согласно одной из них, высокие температуры воздействуют непосредственно на вирусные частицы через их рибонуклеиновую кислоту и белковую оболочку, вызывая физическое разрушение и лишая вирусные частицы инфекционности. Вторая гипотеза состоит в том, что высокая температура действует на вирусы через метаболизм растений. Под влиянием высоких температур нарушается равновесие между синтезом и деградацией вирусных частиц. Если преобладает синтез, то концентрация вируса в зараженных тканях растёт, и наоборот.

     Растения, подвергающиеся термотерапии, помещают в специальные термокамеры, где  в течение первой недели повышают температуру от 25° до 37 °C путем ежедневного увеличения параметров температур на 2 °C. Не менее важно при термотерапии создавать и поддерживать на протяжении всего процесса оптимальные режимы: температуру 37 °C, освещенность лампами дневного света 5 тыс. лк, фотопериод в зависимости от культуры 14—16 ч в сутки при относительной влажности воздуха в термокамере 90 %. Продолжительность термотерапии всецело зависит от состава вирусов и их термостойкости[32]. Если, например, для гвоздики достаточно 10—12-недельного воздействия теплом, то для освобождения хризантемы от Б-вируса этот период длится 12 и более недель. Однако существуют растения, например луковичные культуры, розы и другие, рост которых угнетается в результате длительной термотерапии in vivo. Для таких растений целесообразно проводить термотерапию растений-регенерантов in vitro.

     Помимо  положительного действия термотерапии на освобождение растений от вирусов, выявлен положительный эффект высоких  температур на точку роста и процессы морфогенеза некоторых цветочных  культур (гвоздики, хризантемы, фрезии) в условиях in vitro. Применение термотерапии позволяет увеличить коэффициент размножения на 50—60 %, повысить адаптацию пробирочных растений-регенерантов к почвенным условиям, а также получить более высокий процент безвирусных маточных растений.Проверку растений на наличие вирусов, как правило, проводят с помощью иммуноферментного анализа, электронной микроскопии и травянистых растений-индикаторов[33].

     Другой  способ, применяемый для освобождения растений от вирусов,— хемотерапия. Он заключается в добавлении в  питательную среду, на которой культивируют апикальные меристемы, аналога гуанозина — 1 р-бета-рибофуранозил-1,2,4-триазол-3-карбоскимид (коммерческое название вирозол) в концентрации 20—50 мг/л. Это противовирусный препарат широкого спектра действия. При использовании вирозола в культуральной среде процент безвирусных меристемных растений для ряда обычных для этих растений вирусов увеличивался до 80—100 % при 0—41 % в контроле[32]. Положительные результаты хемотерапии были получены для сливы, черешни, малины, некоторых цветочных и других растений. Термо- и хемотерапевтические методы оздоровления посадочного материала от вирусов экономически малоэффективны. Поэтому в настоящее время с помощью методов трансгеноза создаются формы растений с генетической устойчивостью к вирусам. Методы клеточной и генной инженерии открывают реальные пути уже сейчас получать в массовом количестве элитный, здоровый посадочный материал с заранее заданными свойствами, а также с высокой эффективностью создавать и размножать ценные гибриды[33]. 
 
 
 
 

      2 Особенности клонального  микроразмножения  орхидных 

            Цветочные культуры как  высокодекоративные растения широко применяются  в практике озеленения, ландшафтного дизайна и т.д., в связи с  чем с ними проводится большая  селекционная работа[34]. Процесс сортосмены часто сдерживается ввиду низкого коэффициента вегетационного размножения, который не позволяет получать достаточное число экземпляров растений новых сортов и форм. Поэтому при селекции и размножении традиционными методами для выведения нового сорта требуется 8-10 лет[35]. В настоящее время с целью повышения эффективности селекции многих растений используют биотехнологические методы размножения. При разработке этих методов предпочтение отдают тому типу эксплантов, который характеризуется большой регенерационной способностью.

     Первые  достижения в области клонального  микроразмножения были получены в конце 50-х годов XX столетия французским  ученым Жоржем Морелем, которому удалось получить первые растения-регенеранты орхидей. Успеху Ж. Мореля в микроразмножении способствовала уже разработанная к тому времени техника культивирования апикальной меристемы растений в условиях in vitro. Как правило, исследователи в качестве первичного экспланта использовали верхушечные меристемы травянистых растений: гвоздики, хризантемы, подсолнечника, гороха, кукурузы, одуванчика, салата и изучали влияние состава питательной среды на процессы регенерации и формирования растений. Ж. Морель в своих работах также использовал верхушку цимбидиума (сем. орхидные) состоящую из конуса нарастания и двух-трех листовых зачатков, из которой при определенных условиях наблюдал образование сферических сфер — протокормов. Сформировавшиеся протокормы можно было делить и затем культивировать самостоятельно на вновь приготовленной питательной среде до образования листовых примордиев и корней. В результате им было обнаружено, что этот процесс бесконечен и можно было получать в большом количестве высококачественный и генетически однородный, безвирусный посадочный материал[36].

      Необходимость получения новых гибридных форм для селекции орхидных и ускоренного размножения ценных генотипов стимулирует ученых ряда стран вести разработку усовершенствованных методик микроклонального размножения орхидных в культуре ткани. К примеру, разработали простой, дешевый, эффективный метод, обеспечивающий длительное сохранение in vitro свободных от инфекций целых растений исчезающего вида орхидей, эндемичного для провинции Западной Гате в Керала, в Индии. Так, стратегия, как снижение концентрации солей в среде, отсутствие в среде гормонов и сахара, была приспособлена для сохранения in vitro. Половинная среда МС с 3% агара, 1,5 мг/л кинетина в банках для джема обеспечила сохранение побегов до 14 месяцев без субкультивирования при развитии 25 дополнительных побегов. Снижение сахара в среде увеличило продолжительность хранения до 20 месяцев. Половинная среда без регуляторов роста и сахара (фотоавтотрофная среда) была лучшим вариантом для сохранения in vitro и продолжительность сохранения растительного материала на этой среде достигла 27 месяцев. На этой среде побеги росли очень медленно и редко развивались дополнительные побеги, культура была свободна от контаминации. С 1997 г., около 100 орхидных, находящихся под угрозой исчезновения, были сохранены in vitro как целые растения[37]. Так же изучалась различная концентрация пульпы банана и сока кокоса в питательной смеси Кнудсона для выращивания орхидей. Микрорастения гибрида Gatleya loddgesii Grande* Gatleya loddgesii Alba 1,0-1,5 см помещали в сосуды с 50 мл среды Кнудсона с добавлением сока кокоса (0-200 мл/л) и пульпы банана (0-100 г/л). Через 180 дней при добавлении 100 г/л пульпы банана отмечен самый интенсивный рост растений, самые большие показатели длины и сырой массы корня. Сочетание 50 и 200 мл/л сока кокоса + 100 г/л пульпы банана обеспечивает формирование наибольшего числа корней, наибольшей массы надземных органов. 
 

      2.1 Влияние эндогенных факторов

      На  эффективность микроклонального размножения  влияет масса факторов различной природы. Это физиологические особенности вводимого в культуру растения, химические и физические условия культивирования. Наиболее важным моментом является выбор материнского растения и экспланта.

     При выборе материнского растения необходимо учитывать его физиологические, сортовые и видовые особенности. Исходные растения должны быть здоровы, не поражены грибными, бактериальными и вирусными болезнями. Кроме того, они должны находится в состоянии интенсивного роста (выход из фазы покоя и переход к активному росту).