Введение новой генетической информации в клетки бактерий

     8. 0oС , 5' (не больше!!!);

     9. + 200µl холодного 10М AcONH4, ~5 раз  перевернуть;

     10. 0oС, 5';

     11. ЦФ NT, 5';

     12. супер перенести в пробирку  с 500µl изопропанола, смешать;

     13. NT, 10';

     14. ЦФ NT, 10', сбросить супер;

     15. ЦФ NT, 0.5-1', сбросить остатки изопропанола (не подсушивать);

     16. + 100µl 2М AcONH4, вортекс 20'';

     17. NT, 5';

     18. ЦФ NT, 5', перенести супер в пробирку  со 100µl изопропанола;

     19. NT, 10';

     20. ЦФ NT, 10';

     21. сполоснуть осадок 70% EtOH (~200µl), подсушить.

     не  обязательно:

     21a. + 75µl "ТЕ + RNaseA";

      21b. 37oC, 15';

      21c. + 25µl 10М AcONH4, + 100µl изопропанола;

       21d. NT, 10';

      21e. ЦФ NT, 10';

     22. растворить в 25µl (H20 или TE).

     Комментарии

     п. 1. Дополнение: для выкалывания бактериальных  колоний и старта минипрепов можно  выкалывать колонии 200µl типами и отстреливать их сразу в пробирки со средой - экономит время и стерильно (меньше возни, чем с зубочистками).

     п. 6. Это время необходимо для работы лизоцима. Если лизоцим не добавлен, можно сразу переходить к п.7.

     п. 7. Лизис бактерий и щелочная денатурация DNA. Нужно постараться как можно  меньше раздробить геномную DNA на этом этапе, иначе возникнут проблемы с ее осаждением в п.11.

     Требования, предъявляемые в п.7, противоречивы. Для того, чтобы получить полный лизис, требуется хорошо смешать  бактериальную суспензию с раствором "II", однако, интенсивное смешивание грозит дроблением геномной DNA. Мы поступаем  следующим образом:

     7.1.    непосредственно перед внесением  (<1') раствора "II" вновь взболтать  суспензию бактерий: вортекс - 2-4'';

      7.2.    не касаясь пробирки  типом быстро внести 400µl раствора "II"; сразу же закрыть пробирку; резко встряхнуть 2-3 раза. Для того, чтобы прошел лизис требуется  ~2''. надо уложиться со встряхиванием  в это время;

      7.3.    через ~1' медленно перевернуть  пробирку 2-3 раза.

     п. 8. Превышение времени денатурации  чревато тем, что плазмида денатурирует необратимо - одно кольцо сдвинется  относительно другого так далеко, что достигнет локально устойчивого  состояния. Необратимо денатурированные плазмиды вполне годятся для сиквенса, но не режутся рестриктазами и  обладают аномальной подвижностью на электрофорезе.

     п. 9. Нейтрализация раствора.

     Геномная DNA случайно регибридизуется образуя  большие сети, кольцевая pDNA благополучно ренатурирует. Белки с SDS агрегируют при высокой концентрации соли (на холоду это получается лучше).

     Важно, чтобы нейтрализация была полной и не осталось областей с вязким раствором. Нужно смешивать раствор  вначале мягко, чтобы не дробить  геномную DNA, но после того как она  уже ассоциирует (через ~1'), ничто  не мешает встряхнуть посильнее. Однако, всё же не на вортексе.

     п. 10. Можно прерваться (+4oC, несколько  суток).

     п. 12. В этой методике можно прерваться при любом осаждении нуклеиновых  кислот после добавления спирта (-20oC, любое время).

     п. 15. В этом месте важно работать быстро и аккуратно, так как pDNA будет  плохо растворяться если оставить много  изопропанола или пересушить осадок.

     п. 16. Устранение большей части рибосомной RNA. В высокой соли одноцепочечная RNA образует большие ассоциаты (может  быть за счет случайной гибридизации) и не растворяется. Однако tRNA (видимо, из-за легкости образования внутримолекулярных двухцепочечных участков) сравнительно легко растворяется в высокой  соли. Если требуется устранить и  её, нужно выполнить п.п. 21a-e.

     В этом месте важно работать быстро и аккуратно, так как pDNA будет  плохо растворяться если оставить много  изопропанола или пересушить осадок.

     п. 21. Отмывка от изопропанола.

     п. 21a-e.

     Расщепление tRNA и остатков рибосомной RNA.

     Важно, иметь в виду, что рибонуклеотидтрифосфаты, образующиеся после расщепления RNase вполне способны выпасть в осадок вместе с плазмидной DNA и выдержать  споласкивание 70% EtOH. => измерять концентрацию pDNA с помощью спектрофотометра дело опасное даже после обработки RNase.

     3.3 РЕСТРИЦИРОВАНИЕ

     Рестрикция  ДНК — это разрезание молекулы ДНК специфическими ферментами, которые  называются эндонуклеазами рестрикции, или, на лабораторном жаргоне, — рестриктазами.

       Рестриктазы были найдены у  бактерий. Все рестриктазы разрезают  фосфодиэфирную связь между соседними  нуклеотидами в ДНК. Рестриктные  фрагменты (фрагменты ДНК, образовавшиеся  в ходе рестрикции) имеют фосфатную  группу на 5’-конце и гидроксильную  группу на 3’-конце. Каждая рестриктаза  имеет свой специфический сайт  узнавания. 

       Все рестриктазы делятся на  несколько групп. Рестриктазы  из разных групп различаются  сайтами узнавания, местом разрезания  относительно сайта узнавания  и структурой молекул фермента.

     Рестриктазы II типа.

       В лабораторной практике широко  применяются рестриктазы II типа. Рестриктазы этой группы в  большинстве своем узнают симметричные  сайты (обладающие центральной  осью и считывающиеся одинаково  в обе стороны от оси симметрии,  если смотреть на разных цепях  ДНК). Такие сайты называются палиндромными. 

     Если  прочитать последовательность нуклеотидов  от 5'-конца к 3'-концу на верхней  и на нижней цепях ДНК, можно заметить, что она (последовательность) одинакова. Также если мы мысленно разделим 6 пар  нуклеотидов посередине вертикальной осью и прочитаем последовательность трех нуклеотидов, например, на верхней  цепи вправо от оси и на нижней цепи влево от оси, то получим одинаковые последовательности на верхней и  нижней цепях. Все это говорит  нам о том, что мы имеем дело с палиндромной последовательностью. Некоторую путаницу в распознавание  палиндрома может внести только наличие  у ДНК двух комплементарных цепей.

       Рестриктазы II типа могут по-разному  разрезать свой сайт узнавания.  Обратимся к схеме: 

       Тупые концы образуются, когда  рестриктаза режет цепи ДНК  по связям, расположенным напротив  друг друга. Липкие концы образуются, когда рестриктаза режет цепи  ДНК по связям, не расположенным  друг напротив друга. Когда  образуются 5', а когда 3'-выступающие  концы. 
 

     3.4 ЭЛЕКТРОФОРЕГРАММА

     Электрофорез  — это метод разделения веществ  в электрическом поле на основании  разницы в заряде молекул.

       Методом электрофореза в лабораторной  практике разделяют белки и  нуклеиновые кислоты. 

       Биологические молекулы наносят  на разные носители. Носителями  для разделения веществ методом  электрофореза могут служить  любые химически инертные материалы  с пористой структурой, например, бумага. В лабораториях для разделения  нуклеиновых кислот чаще всего  используют агарозные гели (0,5-2 % w/v), для разделения белков —  гели из полиакриламида. Ячеистая (пористая) структура материала позволяет  одновременно проводить разделение  молекул по размеру и форме. 

     Электрофорез  нуклеиновых кислот

       Известно, что нуклеиновые кислоты  заряжены отрицательно благодаря  наличию фосфатных групп (PO4-), при этом на каждый нуклеотид  приходится одна такая группа, на каждую комплементарную пару  нуклеотидов в молекуле ДНК  — две. В конечном итоге,  заряд всей длинной молекулы  пропорционален ее размеру, который  принято выражать в числе нуклеотидных  пар на молекулу ДНК. Поскольку  нуклеиновые кислоты заряжены  отрицательно, при электрофорезе  они движутся от катода (-) к  аноду (+).  

       Распространенным обозначением  длины молекулы ДНК является 1 килобаз=1 Kb=1000 пар оснований (п.о.) = 1000 base pairs (b.p.).

       Для визуализации нуклеиновых  кислот в геле обычно используют  бромистый этидий (традиционный, более  дешевый и пока еще более  распространенный вариант) или  красители группы SYBR (SYBR Green, SYBR Gold - более  современные и чувствительные  красители). Считается также, что красители группы SYBR более безопасны. Флуоресценция обоих красителей возрастает на много порядков при внедрении в молекулы нуклеиновой кислоты. Молекулы красителей интеркалируют в пространство между основаниями нуклеиновых кислот. Обратите внимание на то, что оба красителя содержат систему сопряженных колец, среди которых есть гетероциклы.

     Агароза — полимер галактозы, который  в природе можно получить из морских  водорослей. Сухую агарозу растворяют в буфере при нагревании (~60°с), добавляют  краситель и заливают в форму (tray), куда предварительно установлена  гребенка для формирования лунок (comb). После застывания гель переносят  в форезную камеру и заливают его  электропроводящим буфером. В лунки, расположенные на одинаковом расстоянии от электродов, вносят раствор ДНК  в специальном буфере нанесения. Включают ток.

       С течением времени молекулы  ДНК все лучше разделяются  в геле, при этом быстрее идут  меньшие фрагменты ДНК. 

       После окончания процедуры гель  освещают светом того диапазона,  который включает в себя длину  волны возбуждения красителя;  полученное изображение фотографируют.  Каждая полоса на геле соответствует  группе молекул ДНК одинакового  размера (одинаковой длины).

     Для определения приблизительного размера  каждой группы молекул в одну из лунок вносят так называемый маркер — смесь фрагментов ДНК известной  длины. Затем строят калибровочную  кривую, где по оси абсцисс —  величина пробега данной молекулы маркера  в мм, а по оси ординат —  десятичный логарифм ее длины в Кб. Зная величину пробега данной группы молекул, по калибровочному графику  можно определить их длину.

     В зависимости от выбранной процентности агарозы статистический размер ячеек  геля будет различным, отличаться будет  и картина разделения одной и той же смеси ДНК в гелях разной процентности. Процентность агарозы подбирают, исходя из задач конкретного эксперимента.

 

     

     Заключение

     В результате точного выполнения всех стадий работы, полученные результаты сошлись с образцом. Это можно  видеть, сравнивая 2 изображения в  приложении.

     Таким образом, выдвинутая Нами гипотеза подтвердилась.

     В ходе работы были достигнуты все поставленные цели и осуществлены задачи.

     Использование методологии генной инженерии в  прикладном аспекте предполагает конструирование  таких рекомбинантных молекул ДНК, которые при внедрении в генетический аппарат придавали бы организму  свойства, полезные для человека.

     Благодаря этому решаются многие прикладные проблемы: получение «биологических реакторов» - микроорганизмов, растений и животных, нарабатывающих фармакологически значимые для человека белковые препараты, создание высоко продуктивных пород животных с определёнными ценными для  человека признаками, выведение растений, устойчивых к различным патогенам  и вредителям и так далее. С  этими же наукоёмкими технологиями связана и генетическая паспортизация, и диагностика генетических заболеваний, и создание ДНК-вакцин, и терапия  различных заболеваний. Таким образом, сложившаяся благоприятная ситуация в биологии явилась мощным толчком  в развитии современной биотехнологии, весьма важной области практического  приложения результатов фундаментальных  наук.