Методика
1.
Одну бактериальную колонию (полученную
в результате эксперимента по
трансформации, как это описано
в протоколе 13.1, или ранее расштрихованную
из хранящейся в глицерине
бактериальной культуры) вносят
в неплотно закрытую пробирку
на 15 мл с 2 мл LB-среды, содержащей
соответствующий антибиотик. Растят
бактериальную культуру при интенсивном
встряхивании (200 об/мин) при 37 С
в течение ночи до ОД600=1Д
2.
Переносят 1,5 мл культуры в
микроцентрифужную пробирку и
собирают клетки центрифугированием
при 12 000 g в течение 1 мин. Оставшуюся
культуру хранят при 4 С.
3.
Отсасывают супернатант и при
интенсивном встряхивании ресуспендируют
осадок бактериальных клеток
в 100 мкл холодного раствора I.
Инкубируют во льду 15 мин.
4.
Добавляют 200 мкл раствора II и
перемешивают смесь быстрым пятикратным
переворачиванием закрытой пробирки
без встряхивания. Инкубируют пробирку
во льду 5 мин.
5.
Добавляют 150 мкл буфера 111, закрывают
пробирку и перемешивают содержимое
осторожным встряхиванием в течение
10 с. Инкубируют во льду 10 мин.
6.
Центрифугируют на микроцентрифуге
при 12 000 g в течение 5 мин при
4 С и отбирают супернатант в новую
пробирку.
7.
Для осаждения двухцепочечной
ДНК добавляют 1 мл холодного
этанола, перемешивают встряхиванием
и на 30 мин помещают на —20 С.
8.
Центрифугируют на микроцентрифуге
при 12 000 g в течение 5 мин при
4 С.
9.
Осторожно отбирают супернатант
и ресуспендируют осадок в
100 мкл раствора IV.
10.
Добавляют 200 мкл этанола, перемешивают
и на 10 мин помещают на —20 °С.
Центрифугируют на микроцентрифуге
при 12 000 g в течение 2 мин при 4 °С.
11.
Отбирают супернатант, добавляют
к осадку 1 мл этанола, центрифугируют
на микроцентрифуге при 12 000 g в
течение 2 мин при 4°С.
12.
Отбирают супернатант, осадок
нуклеиновых кислот подсушивают
на воздухе в течение 10 мин.
Растворяют нуклеиновые кислоты
в 50 мкл ТЭ и хранят при
-20 С.
Обычно
метод, описанный в протоколе, дает
при выделении многокопийных
плазмид типа pUC выход 3-5 мкг ДНК
на 1 мл исходной бактериальной культуры.
Если полученные таким способом мини-препараты
ДНК не удается рестрицировать, то
для удаления загрязнений можно
провести экстракцию фенолом/хлороформом.
Пропорционально увеличив количество
всех необходимых реактивов, можно
использовать данный метод для выделения
ДНК из культур объемом до 10 мл.
2.2
Метод центрифугирования
в градиенте концентрации
хлористого цезия
Высокоэффективным
методом разделения нуклеиновых
кислот, широко используемым при их
очистке, является центрифугирование
в градиенте плотности хлористого
цезия . В этом случае высокая ионная
сила буферного раствора в центрифужных
пробирках способствует диссоциации
комплексов белков и нуклеиновых
кислот, и разделение макромолекул
происходит на основании их различий
в плавучей плотности. Перемещение
макромолекул во время центрифугирования
происходит до тех пор, пока они не достигнут
зоны раствора CsCl с плотностью, равной
их плавучей плотности. В этой зоне происходит
их концентрирование. Метод центрифугирования
в градиенте плотности CsCI в присутствии
бромистого этидия используется в генной
инженерии для получения векторных плазмид
в препаративных количествах. Он позволяет
отделять суперскрученные молекулы ДНК
от релаксированных и линейных, так как
их плавучие плотности заметно различаются
из-за разного количества молекул бромистого
этидия, интеркалированного в эти топологические
изомеры плазмидной ДНК. В практической
генной инженерии для очистки векторных
плазмид центрифугирование в градиенте
плотности CsCI используется редко. В целях
обычного применения рекомбинантных ДНК,
в том числе для молекулярного клонирования,
построения рестрикционных карт и определения
последовательности нуклеотидов (секвенирования),
разработаны методы минипрепаративного
выделения. В одном из них суперскрученные
молекулы рекомбинантных плазмидных ДНК
легко отделяются от линейных молекул
хромосомной и плазмидной ДНК в процессе
щелочной денатурации с последующей быстрой
нейтрализацией раствора. При этом в основном
успевают ренатурировать только суперскрученные
молекулы ДНК, так как две их цепи остаются
физически связанными друг с другом в
процессе денатурации. Образовавшийся
комплекс денатурированной ДНК и белков
отделяется от плазмидной ДНК центрифугированием,
а от основной массы РНК освобождаются
переосаждением в присутствии высокой
концентрации LiCl.
2.3
Щелочной метод
В
основе щелочного метода лежит то,
что в щелочных условиях (при рН
~ 12) происходит денатурация только
линейных молекул ДНК (т. е. разделение
цепей двухцепочечной ДНК клетки-хозяина),
плазмидные же ССС-молекулы не денатурируют.
При нейтрализации клеточного экстракта
в присутствии солей высокой концентрации
денатурированная хромосомная ДНК выпадает
в осадок, поскольку реассоциация длинных
линейных одноцепочечных молекул ДНК
происходит в этих условиях одновременно
во множестве участков с образованием
нерастворимых комплексов.
ГЛАВА
3
РЕЗУЛЬТАТЫ
ИССЛЕДОВАНИЙ
3.1
БАКТЕРИАЛЬНАЯ КУЛЬТУРА
Бактериальная
культура — искусственно выращиваемое
на питательных средах скопление
бактерий одного вида, являющихся потомками
одной бактериальной клетки. Бактериальные
культуры сохраняется на твердых (1,5—2%
мясо-пептонный агар), полужидких (0,5—0,7%
мясо-пептонный агар) или жидких
(мясо-пептонный бульон) питательных
средах.
Для длительного хранения бактериальную
культуру лиофилизируют и
помещают в ампулы. При отсутствии
лиофильной сушки бактериальные
культуры хранят в пробирках
на питательных средах; стерильную
ватную пробку вдвигают внутрь
пробирки и заливают тонким
слоем парафина. Для хранения
бактериальных культур удобно
пользоваться пробирками с навинчивающимися
пробками. Большинство бактериальных
культур лучше сохраняется при
температуре не выше 5—7°.
Пробирки или ампулы с бактериальной
культурой снабжают этикетками
с указанием названия, номера
и даты выделения. Все бактериальные
культуры, выделяемые или хранящиеся
в лаборатории, подлежат регистрации
в соответствии со специальными
инструкциями. См. также Бактериологическое
исследование, Колония бактериальная.
Бактериальная
культура — культивирование популяций
бактерий на тех или иных питательных
средах. Культивирование бактерий на
искусственных питательных средах
лежит в основе всех микробиологических
исследований, позволяющих выяснить
морфологические, физиологические
и другие особенности бактерий.
В зависимости от питательных
потребностей бактерий бактериальные
культуры могут быть получены
на средах, в состав которых
входят органические субстраты,
или на солевых синтетических
средах, включающих в качестве
источника энергии углеродсодержащие
соединения. При посеве бактерий
на питательные среды наблюдается
сложный процесс роста бактериальных
культур, в котором следует
различать рост (увеличение размера)
отдельных бактериальных клеток
и их размножение, т. е. нарастание
числа жизнеспособных особей. Рост
отдельных бактерий можно наблюдать
под микроскопом или путем
микрокиносъемки в специальных
камерах, процесс же размножения
анализируют путем высева на
плотные питательные среды с
последующим подсчетом числа
бактериальных колоний.
В процессе культивирования происходит
не только размножение, но и
отмирание бактерий. Следовательно,
полное представление об интенсивности
размножения клеток бактериальных
культур можно получить только
в том случае, если подсчитывать
не только число жизнеспособных
особей, но и общее количество
бактерий.
Процесс размножения складывается
из следующих фаз: 1) приспособления
(lag-фаза), 2) интенсивного деления
(log-фаза), 3) отрицательного ускорения,
4) стационарной фазы максимума, 5)
ускоренной гибели, 6) логарифмической
гибели, 7) уменьшения скорости отмирания.
В начале lag-фазы, т. е. сразу
после посева бактерий в питательную
среду, клетки не делятся, иногда
наблюдается уменьшение числа
жизнеспособных особей; затем бактерии
начинают расти, а к концу
lag-фазы и делиться. Логарифмическая
фаза роста бактериальных культур
(log-фаза) характеризуется максимальной
скоростью деления клеток, увеличение
числа которых происходит в
геометрической прогрессии. При
этом абсолютное большинство
клеток делится с равной скоростью,
а гибель их минимальна. В фазе
отрицательного ускорения время
генерации клеток постепенно
удлиняется, а скорость деления по сравнению
с log-фазой снижается. Это связано с истощением
питательной среды, нарушением кислородного
снабжения и накоплением токсических
продуктов метаболизма. Одновременно
со снижением скорости деления увеличивается
процент погибающих клеток, что приводит
к замедлению темпа нарастания жизнеспособных
особей в бактериальной культуре. Следующая
фаза—стационарная — характеризуется
равновесием процессов размножения и
гибели клеток, вследствие чего число
жизнеспособных бактерий в 1 мл среды остается
постоянным. Это число соответствует максимальной
концентрации (М-концентрация) жизнеспособных
особей бактериальной культуры. В течение
последующих фаз гибель клеток превалирует
над увеличением их числа, в результате
чего количество жизнеспособных бактерий
снижается. Продолжительность фаз роста
Б. к., время генерации и М-концентрация
клеток зависят от вида бактерий, состава
среды, посевной дозы, возраста культуры
и ряда других факторов.
С целью получения больших
количеств бактериальной массы
аэробов бактериальные культуры
выращивают в условиях искусственной
аэрации. Это позволяет достигать
значительно более высоких М-концентраций
по сравнению с неаэрируемыми
бактериальными культурами. Длительное
сохранение бактериальных культур
в состоянии log-фазы достигается
путем постепенного и постоянного
обновления среды (проточное культивирование).
При выращивании ауксотрофных
мутантов бактерий, т. е. бактерий,
утративших способность синтезировать
какое-либо вещество (аминокислота,
азотистое основание и др.), могут
быть созданы условия так называемого
хемостата, обеспечиваемые постоянным
добавлением в среду необходимого
вещества в определенной концентрации.
Варьируя количество вносимого
в среду соединения, меняют скорость
деления ауксотрофных мутантов
бактерий. Условия хемостата могут
быть созданы и для бактерий
дикого типа в том случае, если они не способны
синтезировать какие-либо необходимые
для питания вещества.
Все сказанное относится к
чистым бактериальным культурам,
т. е. к популяциям бактерий
одного штамма. Штамм — более
узкое понятие, чем вид (см.).
Термином «штамм» обозначают
сохраняемые и перевиваемые бактериальные
культуры того или иного вида
бактерий, полученные из различных
источников. Выделение чистых Б.
к. и их культивирование производят
специальными методами (см. Бактериологическая
техника). В естественных условиях
чистые Б. к. обнаруживаются
крайне редко. Сапрофитные бактерии,
обычно населяющие организм человека
и животных, а также обитающие
во внешней среде, составляют
естественные биоценоза (см.), для
которых характерны явления антагонизма,
синергизма и т. п. В случае
инфицирования организма патогенные
бактерии также размножаются
в смешанных популяциях. Следовательно,
если для диагностики инфекций
и идентификаций бактерий обязательным
условием служит выделение чистых
бактериальных культур, то для
изучения процессов, лежащих в
основе развития инфекционных
заболеваний, целесообразен анализ
явлений, возникающих в смешанных
Б. к. , которые состоят из популяций
бактерий различных видов и
штаммов.
3.2
ВЫДЕЛЕНИЕ ПЛАЗМИДНОЙ
ДНК
В
основе щелочного метода лежит то,
что в щелочных условиях (при рН
~ 12) происходит денатурация только
линейных молекул ДНК (т. е. разделение
цепей двухцепочечной ДНК клетки-хозяина),
плазмидные же ССС-молекулы не денатурируют.
При нейтрализации клеточного экстракта
в присутствии солей высокой
концентрации денатурированная хромосомная
ДНК выпадает в осадок, поскольку
реассоциация длинных линейных одноцепочечных
молекул ДНК происходит в этих
условиях одновременно во множестве
участков с образованием нерастворимых
комплексов.
1.
растить ночную культуру 16-24 часа
в богатой среде: 37oС, 200-300rpm;
2.
1.5ml ночной культуры поместить
в 1.7ml пробирку, ЦФ 30'', удалить супер;
3.
п.2. - ещё 2 раза;
4.
ЦФ 10'' дополнительно, отсосать остатки
среды;
5.
ресуспензировать осадок в 200µl
раствора "I", вортекс 5'';
6.
NT, 5';
7.
+ 400µl раствора "II", резко вылить,
сразу же резко встряхнуть. перевернуть
~5 раз;