Процесс брожения

  Общая характеристика процессов  брожения

  «Брожение»  — это сугубо микробиологический термин. Он характеризует энергетическую сторону способа существования нескольких групп эубактерий, при котором они осуществляют в анаэробных условиях окислительно-восстановительные превращения органических соединений, сопровождающиеся выходом энергии, которую эти организмы используют. Поскольку брожение протекает без участия молекулярного кислорода, все окислительно-восстановительные превращения субстрата происходят за счет его «внутренних» возможностей. Процесс брожения связан с такими перестройками органических молекул субстрата, в результате которых на окислительных этапах процесса высвобождается часть свободной энергии, заключенной в молекуле субстрата, и происходит ее запасание в молекулах АТР. В процессе брожения, как правило, происходит расщепление углеродного скелета молекулы субстрата.

  Круг  органических соединений, которые могут  сбраживаться, довольно широк. Это углеводы, спирты, органические кислоты, аминокислоты, пурины, пиримидины. Химическое вещество может быть подвергнуто сбраживанию, если оно содержит неполностью окисленные (или восстановленные) углеродные атомы. В этом случае есть возможность для окислительно-восстановительных преобразований между молекулами (или внутри одного вида молекул), возникающими из субстрата. В результате одна часть продуктов брожения будет более восстановленной, другая — более окисленной по сравнению с субстратом. Продуктами брожений являются различные органические кислоты (молочная, масляная, уксусная, муравьиная), спирты (этиловый, бутиловый, пропило-вый), ацетон, а также С0₂ и Н₂. Обычно в процессе брожения образуется несколько продуктов. В зависимости от того, какой основной продукт накапливается в среде, различают молочнокислое, спиртовое, маслянокислое, пропионовокислое и другие виды брожений.

  Следовательно, в каждом виде брожения можно выделить две стороны: окислительную и  восстановительную. Процессы окисления сводятся к отрыву электронов от определенных метаболитов с помощью специфических ферментов (дегидрогеназ) и акцептированию их другими молекулами, образующимися из сбраживаемого субстрата, т.е. в процессе брожения происходит окисление  анаэробного типа.

  Спиртовое брожение, вызываемое дрожжами и бактериями

  Этиловый спирт (этанол) - один из широко распространенных продуктов сбраживания сахаров микроорганизмами. Даже растения и многие грибы в анаэробных условиях накапливают этанол. Главные продуценты этанола - дрожжи, особенно штаммы Saccharomyces cerevisiae. Дрожжи, как и большинство других грибов, осуществляют аэробное дыхание, но без доступа воздуха они сбраживают углеводы до этанола и С0₂. У ряда анаэробных и факультативно-анаэробных бактерий этиловый спирт тоже является главным или побочным продуктом сбраживания гексоз или пентоз. Сбраживание глюкозы до этанола и С0₂ дрожжами (Saccharomyces cerevisiae) осуществляется по фруктозобисфосфатному пути. Превращение пирувата в этанол происходит в два этапа. Сначала пируват декарбоксилируется пируватдекарбоксилазой при участии тиаминпирофосфата до ацетальдегида, а затем ацетальдегид восстанавливается алкогольдегидрогеназой в этанол при участии NADH. Переносится при этом водород, образующийся при дегидрировании триозофосфата; окислительно-восстановительный баланс, таким образом, сохраняется.

  Сбраживание дрожжами глюкозы - анаэробный процесс, хотя дрожжи аэробные организмы. В анаэробных условиях брожение идет очень интенсивно, но роста дрожжей почти не происходит. При аэрации брожение ослабевавает, уступая место дыханию. У некоторых дрожжей можно почти полностью подавить брожение усиленной аэрацией (эффект Пастера). Пастер открыл этот эффект более ста лет тому назад, исследуя процессы брожения при изготовлении вина. Это явление свойственно не только дрожжам, но и всем другим факультативно-анаэробным клеткам, включая клетки тканей высших животных.

  Процесс спиртового брожения суммарно можно  выразить следующим уравнением:

  С₆Н₁₂0₆+ 2Ф_н+ 2АДФ —>2СН₃-СН₂ОН + 2С0₂+ 2АТФ + 2Н₂0.

  Известный для дрожжей путь образования  этанола (фруктозобисфос-фатный путь, пируватдекарбоксилазная реакция) из всех исследованных бактерий обнаружен только у Sarcina ventriculi.

  Из пульке - бродящего сока агавы (Agave mexicana) в Мексике была выделена палочковидная подвижная бактерия с полярными жгутиками, образующая этанол. Эта бактерия Zymomonas mobilis разлагает глюкозу по 2-кето-3-дезокси-6-фосфоглюконатному пути и расщепляет пируват с помощью пируватдекарбоксилазы на ацетальдегид и двуокись углерода. Ацетальдегид восстанавливается до этанола. Единственными продуктами этого брожения являются этанол, С0₂ и небольшие количества молочной кислоты. Интересно, что в водке, приготовленной из сока агавы, обнаруживаются углеродные атомы 2, 3, 5 и 6 глюкозы, тогда как в спирте, образуемом дрожжами, содержатся углеродные атомы.

  При брожениях, вызываемых некоторыми видами Enterobacteriaceae и клостридиями, этанол является побочным продуктом. Предшественник этанола -ацетальдегид- образуется в этом случае не прямо из пирувата (под действием пируватдекарбоксилазы), а путем восстановления ацетил-СоА.

  Молочнокислое брожение и семейство Lactobacillaceae

  Молочнокислые бактерии объединяют в сем. Lactobacillaceae. Хотя эта группа морфологически гетерогенна (включает длинные и короткие палочки, а также кокки), в физиологическом отношении ее можно охарактеризовать достаточно хорошо. Все относящиеся к ней бактерии грам-положительны, не образуют спор (за исключением Sporolactobacillus inulinus) и в подавляющем большинстве неподвижны. Все они используют в качестве источника энергии углеводы и выделяют молочную кислоту. В отличие от Enterobacteriaceae, тоже образующих лактат, молочнокислые бактерии способны только к брожению; они не содержат гемопротеинов (таких, как цитохромы и каталаза). Несмотря на это, Lactobacteriaceae могут расти в присутствии кислорода воздуха; будучи анаэробами, они все же аэротолерантны. Если какая-нибудь бактерия растет в аэробных условиях, но не образует каталазу, ее с большой вероятностью можно отнести к молочнокислым бактериям.

  Распространение молочнокислых бактерий в природе определяется их сложными потребностями в питательных веществах и способом получения энергии (только брожение). Эти бактерии почти никогда не обнаруживаются в почве или водоемах. В естественных условиях они встречаются:

  а) в молоке, местах его переработки и молочных продуктах 
(Lactobacillus lactis, L. bulgaricus, L. helveticus, L. casei, L. fermentum, L. 
brevis; Streptococcus lactis, S. diacetilactis);

  б) на растениях и на разлагающихся растительных остатках 
(Lactobacillus plantarum, L. delbriickii, L. fermentum, L. brevis; Streptococcus 
lactis; Leuconostoc mesenteroides);

  в) в кишечнике и на слизистых оболочках человека и животных 
(Lactobacillus acidophilus; Bifidobacterium; Streptococcus faecalis, S. 
salivarius, S. bovis, S. pyogenes, S. pneumoniae).

  Streptococcus faecalis -обычный обитатель кишечника человека; S. bovis распространен в пищеварительном тракте жвачных. Многие стрептококки являются безобидными обитателями слизистых рта, дыхательных и мочевых путей, половых органов; однако среди стрептококков есть и паразиты крови-весьма вирулентные возбудители болезней.

  Гомоферментативные  молочнокислые бактерии образуют практически  только одну молочную кислоту (она составляет не менее 90% всех продуктов брожения). Катаболизм глюкозы происходит у них по фруктозобисфосфатному пути (бактерии обладают всеми необходимыми для этого ферментами, включая альдолазу), а водород, отщепляющийся при дегидрировании глицеральдегид-3-фосфата, передается на пируват.  
 

  Лишь  небольшая часть пирувата декарбоксилируется, превращаясь в уксусную кислоту, этанол и С0₂, а также в ацетоны. Количество образующихся побочных продуктов зависит, по-видимому, от доступа кислорода.

  Последовательность  биохимических реакций, лежащих в основе гомоферментативного молочнокислого брожения, получила название гликолитического пути (гликолиза), фруктозоди-фосфатного пути, или пути Эмбдена—Мейергофа—Парнаса (H.Embden, О.Meyerhof, Я.О.Парнас), по именам исследователей, внесших большой вклад в изучение этого процесса. Основными энергетическими ресурсами для эубактерий, осуществляющих гомоферментативное молочнокислое брожение, служат моносахара (в первую очередь глюкоза) и дисахара (мальтоза, лактоза).

У гетерофермента-тивных молочнокислых бактерий нет главных ферментов фруктозобис-фосфатного пути - альдолазы и триозофосфат-изомеразы. Начальное превращение глюкозы идет у них исключительно по пентозофосфатному пути, т. е. через глюкозо-6-фосфат, 6-фосфоглюконат и рибулозо-5-фосфат. Рибулозо-5-фосфат под действием эпимеразы превращается в ксилулозо-5-фосфат, который в результате тиаминпиро-фосфат-зависимой   реакции,   катализируемой   пентозофосфокетолазой, расщепляется с образованием глицеральдегидфосфата и ацетилфосфата:

  Нерастущие, отмытые клетки Leuconostoc mesenteroxd.es сбраживают глюкозу почти стехиометрически согласно уравнению

  С₆Н₁₂О_б   -► СН₃—СНОН—СООН   +   СН₃—СН₂ОН   +   С0₂

  в лактат, этанол и двуокись углерода. Таким образом, у этих бактерий ацетилфосфат восстанавливается через ацетил-СоА и ацетальдегид в этанол.

  Глюкозо-1-фосфат, образующийся в результате подготовительных превращений углеводов, иных, чем глюкоза, превращается затем в глюкозо-6-фосфат. Перемещение фосфатной группы из положения 1 в положение 6 катализируется ферментом фосфоглюкомутазой. Дальнейшее превращение глюкозо-6-фосфата одинаково независимо от исходного энергетического субстрата.

  Молекула  глюкозо-6-фосфата изомеризуется  в молекулу фрук-тозо-6-фосфата. Последний  фосфорилируется в положении 1. Донором фосфата служит АТФ. Вторичное фосфорилирование молекулы фруктозы приводит к ее дальнейшему активированию.

  Образовавшийся  фруктозо-1,6-дифосфат разрывается на две триозы: фосфодиоксиацетон и 3-ФГА. Разрыв катализируется фруктозе-1,6-дифосфатальдолазой (альдолазой), являющейся ключевым ферментом этого пути. Достаточно обнаружить альдолазу, чтобы получить свидетельство существования гликолитического пути у организма. В последующие реакции может включаться только 3-ФГА. Фосфодиоксиацетон превращается в 3-ФГА в реакции изомеризации, катализируемой триозофосфатизомеразой.

  На  этом этапе заканчивается подготовительная стадия гликолитического пути: молекула глюкозы после активирования и расщепления на 2 фосфотриозы подготовлена для последующих превращений. Для активирования 1 молекулы глюкозы тратятся 2 молекулы АТФ¹. Таким образом, до сих пор процесс протекает с затратой энергии. Окисление 3-ФГА до 1,3-дифосфоглицериновой кислоты — один из наиболее важных этапов гликолитического пути, поскольку именно на этом этапе энергия, освобождающаяся при окислении альдегидной группы 3-ФГА, запасается в молекуле 1,3-ФГК. Реакция катализируется ферментом 3-ФГА-дегидрогеназой:

  3-ФГА + НАД⁺ + Ф_н —► 1,3-ФГК + НАД × Н₂.

  3-ФГА  служит донором электронов, которые переходят на НАД⁺, функционирующий в качестве переносчика электронов от 3-ФГА к пировиноградной кислоте. Образование последней происходит на более поздних этапах гликолитического пути. Итак, альдегидная группа 3-ФГА окисляется до карбоксильной группы. Однако вместо свободной карбоновой кислоты образуется смешанный ангидрид фосфорной кислоты и карбоксильной группы 3-ФГК— 1,3-ФГК. Реакция окисления 3-ФГА до 1,3-ФГК с помощью НАД-зависимой 3-ФГА-дегидрогеназы состоит из нескольких этапов, в результате чего энергия, освобождающаяся при окислении 3-ФГА, запасается в макроэргической фосфатной связи у первого углеродного атома 1,3-ФГК. 1,3-ФГК реагирует далее с АДФ, отдавая высокоэнергетическую фосфатную группу, что приводит к синтезу молекулы АТФ. Таким образом, энергия, высвободившаяся при окислении альдегидной группы, оказывается запасенной в молекуле АТФ.

  Итак, произошло образование 3-ФГК. Теперь можно подвести некоторые итоги. Клетка на этом этапе «вернула» свои энергетические затраты: 2 молекулы АТФ были затрачены и 2 молекулы АТФ синтезировались на 1 молекулу глюкозы. На этом же этапе в реакции окисления 3-ФГА до 1,3-ФГК и образования АТФ имеет место первое субстратное фосфорилирование. Энергия освобождается и запасается в макроэргических фосфатных связях АТФ в процессе перестройки сбраживаемого субстрата при участии ферментов. Реакция, ведущая к субстратному фосфорилированию, может быть проведена в пробирке. Все необходимые для этого компоненты известны и получены в чистом виде. Возможность осуществления реакции в пробирке указывает на то, что фермент, катализирующий ее, не связан с клеточными структурами. Первое субстратное фосфорилирование носит еще название фосфорилирования на уровне 3-ФГА.

  После образования 3-ФГК фосфатная группа из третьего положения переносится во второе. Далее происходит отщепление молекулы воды от второго и третьего атомов углерода 2-ФГК, катализируемое ферментом енолазой, и образуется фосфоенол-пировиноградная кислота. В результате происшедшей дегидратации молекулы 2-ФГК степень окисления ее второго углеродного атома увеличивается, а третьего — уменьшается. Таким образом, данная реакция по существу представляет собой внутримолекулярный окислительно-восстановительный процесс. Дегидратация молекулы 2-ФГК, приводящая к образованию ФЕП, сопровождается перераспределением энергии внутри молекулы, в результате чего фосфатная связь у второго углеродного атома из низкоэнергетической в молекуле 2-ФГК превращается в высокоэнергетическую в молекуле ФЕП.

  Молекула  ФЕП становится донором богатой  энергией фосфатной группы, которая переносится на АДФ с помощью фермента пируваткиназы. Таким образом, в процессе превращения 2-ФГК в пировиноградную кислоту имеет место высвобождение энергии и запасание ее в молекуле АТФ. Это второе субстратное фосфорилирование. По ряду черт оно отличается от первого субстратного фосфорилирования: 1) если в первом случае образование макроэргической фосфатной связи протекало одновременно с присоединением к субстрату фосфатной группы, то во втором — фосфатная группа была присоединена к молекуле субстрата задолго до этого события; 2) первое субстратное фосфорилирование связано с реакцией окисления, приводящей к тому, что от молекулы 3-ФГА отрываются два электрона и переходят на НАД⁺, т.е. молекула 3-ФГА служит донором электронов, но вопрос о конечном акцепторе их на этом этапе не решен. Напротив, при втором субстратном фосфорилировании, связанном с реакцией дегидратации молекулы 2-ФГК, решается проблема и донора и акцептора: Здесь в результате внутримолекулярного окислительно-восстановительного процесса одна молекула и донирует и акцептирует электроны.