Моноклональные антитела

     Радиоактивные метки.

     Одним из важных этапов в проведении анализа является выбор маркера и способа его «привязки» к антигену. Первоначально широко применялись радиоизотонные метки (радиоиммунный анализ - РИА), предложенные американскими исследователями С. А. Берсон, Р. С. Ялоу в 1959 году. Но в последние годы в качестве маркеров больше используются ферменты, что обусловлено рядом трудностей, связанных с применением изотопныx маркеров. Так, изотоп ¹²⁵I имеет время полураспада 60 суток, чем ограничивается срок его использования.

Изотоп ³Н имеет длительное время жизни (12,5 лет), но под действием бэта-излучения происходит распад молекул антигена, в результате чего время жизни меченых 3Н-соединений тоже ограничено. Ограничивающими факторами РИА являются сложность и высокая стоимость оборудования, необходимость централизованной системы распределения иммунохимических наборов, меченных радиоактивными изотопами, определенная опасность изотопов для окружающей среды. Учитывая трудности использования радиоизотопных меток, были предложены в качестве маркеров ферменты.

     При иммуноферментном анализе антиген  связывается с поверхностью лунки  полистирольного планшета. В лунку  добавляют антитела, несущие фермент  в качестве метки, инкубируют и отмывают. Далее приливают субстрат, который  меняет окраску при взаимодействии с этим ферментом. Изменение окраски можно измерить с помощью спектрофотометрии. Таким способом проводится индикация и количественная оценка биоорганических соединений с чувствительностью до 10-12 г/литр.

     В настоящее время известно более 2000 разных ферментов, однако только некоторые находят применение в иммуноферментном анализе. Это объясняется высокими требованиями, предъявляемыми к свойствам ферментов. Фермент должен быть высоко активен, а продукты его реакции детектироваться с высокой чувствительностью, он должен быть стабилен, так чтобы его активность сохранялась не менее одного года. Содержание фермента-маркера в определяемом образце должно быть минимальным. Именно из-за этого для разных объектов используют разные ферменты. Во многих случаях, когда необходим качественный результат, оценка иммунохимической реакции может быть проведена визуально.

     Для введения ферментативной метки разработано  много разных химических, биохимических  и иммунологических способов.

     Первым  реагентом, использованным для синтеза иммуноферментных конъюгатов, был глутаровый альдегид, реагирующий с аминогруппами лизина белковых молекул. С помощью глутарового альдегида получены конъюгаты антител и антигенов с пероксидазой, щелочной фосфатазой, глюкоамилазой. В настоящее время широко используются иммунопероксидазные конъюгаты и конъюгаты с бэта-галактозидазой.

     Ковалентные методы получения иммуноферментных конъюгатов нашли весьма широкое  распространение, но в некоторых случаях действие сшивающего реагента отрицательно сказывается на ферментативной и иммунологической активности компонентов гибридной макромолекулы. В связи с этим определенный интерес представляют иммунологические методы введения ферментной метки.

     Один  из подходов получил название метода «гибридных антител». Ферментативным гидролизом получают Fab-фрагменты молекул антител против определяемого антигена и используемого фермента. Затем смесь продуктов гидролиза подвергают восстановлению меркаптоэтанодом; при этом Fab-фрагменты обратимо диссоциируют на симметричные части. После удаления восстанавливающего агента молекулы снова ассоциируют, образуя гибридные молекулы антител, специфичные к определяемому антигену и ферменту. При добавлении фермента образуется комплекс антитело—фермент. Гибридомная технология открывает принципиально новый путь получения гибридных антител, который заключается в том, что сливаются моноклональные клетки, специфичные против данного антигена и фермента-маркера, в результате чего образуются гибридомы второго поколения, синтезирующие антитела, с двумя специфичностями.

     Другой  путь заключается в том, что получают антитела одного и того же вида животного (например, кролика) против определяемого  антигена и фермента, которые соединяют  между собой через антитела другого  вида животных (антитела барана против кролика). Добавление фермента к такой тройной молекуле также приводит к образованию комплекса антитело—фермент. В настоящее время разрабатываются подходы получения гибридных антител методами клеточной и генной инженерии, что позволит существенно упростить способ их получения.

     Стабильность  иммуноферментных конъюгатов при хранении — важнейший параметр, обусловливающий  возможность их практического использования. Методы направленной стабилизации конъюгатов пока еще не разработаны. Не существует также корреляции между стабильностью конъюгатов и методом их получения. Однако высокая стабильность гибридных молекул обеспечивает их применение на практике и значительно превосходит стабильность антител и антигенов, меченных радиоактивными изотопами. В лиофилизованном состоянии ферментные конъюгаты сохраняют свои свойства до двух лет.

     Кроме ферментов в качестве маркеров могут  быть использованы субстраты. В частности, в иммунокофакторном анализе  применяются в качестве меток  АТФ и НАД, которые могут быть «пришиты» к молекуле антигена через адениновый остаток таким образом, что сохраняется их способность взаимодействовать с ферментом. Аналогично были использованы субстраты пероксидазы (люминол, изолюминол), которые могут быть окислены пероксидом водорода в реакции хемилюминесценции, катализируемой пероксидазой. 

     5. Применение моноклональных антител 

     Наиболее  широко используются моноклональные антитела в медицинской диагностике. Разработаны  сумки-укладки для постановки диагнозов. Если к антителами присоединить радиоактивные или магнитоактивные материалы и ввести их в живой организм, то можно выявить в нем патологические зоны. Такие МКА присоединяются к пораженным болезнью клеткам организма, а соответствующие индикаторные материалы позволяют выяснить их местонахождение.

     МКА используются и в процессах очистки веществ. Современные технологии основаны на присоединении антител к твердой матрице носителя. К ним добавляют смесь молекул, содержащую искомый антиген. Затем комплексы антиген - антитело отмываются от примесей, не связанных с матрицей. После разрушения ковалентных связей антиген - антитело в растворе остаются свободные антигены.

     Если  получить антитела определенного типа и иммунизировать ими животное, то образуются анти-антитела (анти-идиотипные антитела). Они действуют на иммунную систему как псевдоантиген и поэтому могут быть использованы для ее стимуляции. На этом принципе основано получение вакцин нового типа. Наборы МКА могут быть также предназначены для борьбы с аллергенами.

     Моноклональные  антитела и “мишенная” лекарственная терапия. Предполагается, что большое разнообразие раковых заболеваний обусловлено активацией эндогенных генов, вызванной химическими агентами, внутренними хромосомными перестройками. Эти гены кодируют определенные белки, и поэтому раковые клетки могут содержать уникальные белки на поверхности клетки. Возможно, именно эти белки участвуют в супрессии роста здоровых клеток. Инактивируя эти белки, можно тормозить рост раковых клеток.

     Благодаря высокий специфичности МКА широко используются в качестве зондов для точного определения природы молекул поверхности клеток и клеточных органелл. С их помощью также можно проводить детекцию активности ферментов.

     Методы  иммуноферментного анализа применяют  в диагностике вирусных заболеваний  растений. Это позволяет сократить время получения безвирусного посадочного материала, отбирать новые вирусоустойчивые сорта. При генно-инженерных экспериментах можно быстро отбирать клоны - продуценты. 
 
 

     Заключение 

     Получение и использование моноклональных антител - одно из существенных достижений современной иммунологии. С их помощью можно определить любое иммуногенное вещество. В медицине меченые изотопами или другим способом моноклональные антитела используются для диагностики рака и определения локализации опухоли, для диагностики инфаркта миокарда. Получены моноклональные антитела к различным возбудителям: малярии, трипаносомозу, лейшманиозу, токсоплазмозу и др. Ученые считают, что в самом ближайшем будущем моноклональные антитела займут доминирующее положение в диагностике болезней.

     Для использования в терапии моноклональные антитела можно соединять с лекарством (например, с токсическими веществами). Благодаря специфичности антител они доносят это вещество непосредственно к раковым клеткам или патогенным микроорганизмам, что позволяет значительно повысить эффективность лечения. Можно использовать моноклональные антитела для определения пола у крупного рогатого скота на предимплантационной стадии развития, а также для стандартизации методов типирования тканей при трансплантации органов, при изучении клеточных мембран (так были изучены антигены Т-лимфоцитов), для построения антигенных карт вирусов, возбудителей болезней. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

     Список  использованной литературы 

1.Албертс Б., Брей Д., Льюис Дж. и др. Молекулярная  биология клетки. Т. 1. М. : Мир, 1994. 

2. Тартаковский А.Д. Питательные среды для культивирования клеток млекопитающих. Методы культивирования клеток. Л.: Наука, 1988. С. 44 - 63. 

3.Фрешни Р.  Культура животных клеток. Методы. М.: Мир, 1989. 318 с. 

4.Фридлянская И.И. Получение моноклональных антител (гибридомная технология). Методы культивирования клеток. Л.: Наука, 1988. С. 194 - 205. 

5. Петухов В.Л., Короткевич О.С., Стамбеков С.Ж.  и др. Генетика. Учебник. Новосибирск:  СемГПИ, 2007.