Моноклональные антитела

     Содержание

     1. Введение ………………………………………………………………………………2

     2. Функциональная структура антител…………………………………………………3

     3. Получение моноклональных антител………………………………………………..5

     4. Методы анализа на основе моноклональных антител………………………….…..7

     5. Применение моноклональных антител…………………………………………..…11

     6. Заключение…………………………………….…………………………………..…12

     7. Список использованной литературы………………………………………………..13 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

     Введение  

     При введении в организм животных и человека чужеродных макромолекулярных веществ — белков или полисахаридов (антигенов) в крови появляются  защитные белки - антитела, для которых характерна уникальная специфичность. Каждое антитело узнает только свой антиген, - точнее, одну его детерминантную группу. Детерминантная группа состоит из нескольких аминокислот (обычно из 6—8), образующих пространственную  структуру, характерную для данного белка.

     В одном белке, состоящем из нескольких сотен аминокислот имеется несколько (5-15) разных детерминант, поэтому к одному белку образуется целое семейство различных по своей специфичности антител. Даже к одной детерминанте образуется целый спектр антител, которые отличаются по структуре, степени  специфичности и прочности связывания с ней. Детерминантные группы полисахариднымх антигенов образуются 3—6 остатками моносахаридов.

     Таким образом, при введении антигена возникает  большое семейство антител, направленных к разным его детерминантам. В каждой возникшей группе антитела, направленные к одной детерминанте, различаются между собой. В крови иммунизированных животных появляется богатый и уникальный по составу спектр антител, который и обеспечивает абсолютную специфичность в распознавании данного антигена.

     Антитела  используются для нейтрализации  бактериальных токсинов (дифтерийного, столбнячного), змеиных ядов (кобры, гадюк) вирусов, попавших в кровь (особенно эффективно вируса кори), и для идентификации индивидуальных белков (и других антигенов), находящихся в  клетке или сложнейших тканевых экстрактах. Однако иногда требуются не многокомпонентные смеси антител, возникающие в крови в ответ на введение антигена, а отдельные, элементарные составляющие этой смеси, направленные лишь к одной детерминанте антигена и имеющие одни и те же характеристики. Такие антитела бывают нужны как для изучения их собственной природы, так и для практического использования, например для ставки в опухоли токсических веществ. 
 
 
 
 
 

     2. Функциональная структура антител 

     Моноклональные  антитела - это иммуноглобулины, синтезируемые одним клоном клеток. Антитела синтезируются в организме как проявление защитной реакции при попадании в него чужеродного вещества (антигена). Моноклональное антитело связывается только с одной антигенной детерминантой на молекуле антигена.

     Иммунная  система вырабатывает специфические  антитела на большое количество антигенов. Эта способность обусловлена наличием большого многообразия клонов лимфоцитов, каждый из которых вырабатывает антитела с узкой специфичностью. Антитела, в совокупности называемые иммуноглобулинами (Ig), составляют один из главных белковых компонентов крови - по весу около 20% суммарного белка плазмы.

     В качестве антигенов выступают различные  вещества: клетки микроорганизмов, вирусы, белки, нуклеиновые кислоты, в некоторых  случаях низкомолекулярные вещества типа антибиотиков или пестицидов. Антитела образуются не против всей молекулы белка или бактериальной клетки, а только к небольшим участкам на их поверхности – к антигенным детерминантам. Для  белковой молекулы антигенной детерминантой являются участки поверхности, содержащие около 5 аминокислотных остатков.

       Простейшие молекулы антител  имеют форму буквы Y с двумя  идентичными антиген-связывающими  участками - по одному на конце  каждой из двух “ветвей”. Защитный механизм действия антител основан на том, что при связывании антигенных детерминант происходит потеря определенных функций молекулы или клетки.

     Поскольку участков два, они могут сшивать  антигены:

     Если  молекула антигена имеет три или  больше антигенных детерминант, то антитела могут сшивать их в обширную сеть. Достигнув определенных размеров, такая сеть может выпасть из раствора в осадок:

     Способность больших иммунных комплексов к осаждению (преципитации) дает возможность выявления антител и антигенов. Образование таких комплексов может приводить к агглютинации (склеиванию) молекул. Это явление лежит в основе определения групп крови, когда эритроциты склеиваются антителами той или иной специфичности - реакция гемагглютинации.

     Молекула  антитела образована четырьмя полипептидными цепями: 

     Две из них - идентичные легкие (L-цепь, из 220 аминокислот), а две - тяжелые (H-цепь, из 440 аминокислот). Все четыре цепи соединены между собой нековалентными и ковалентными (дисульфидыми) связями. Антиген-связывающие участки образуются за счет одной H и одной L-цепи. Эффективность реакций связывания антигена возрастает благодаря гибкому шарнирному участку антитела, который позволяет изменять расстояние между двумя антиген-связывающими участками. Шарнирный участок находится на H-цепи. H-цепь образует также “хвостовой” участок молекулы, который содержит также одну или несколько олигосахаридных цепочек, функция которых неясна. Как L, так и Н-цепь построены из повторяющихся сегментов, или доменов, каждый из которых сворачивается независимо, образуя компактную функциональную единицу (эпитоп). Эти участки также могут выступать в качестве антигенных детерминант и, соответственно, связываться другими антителами. 
 
 
 
 

     3. Получение моноклональных антител 

     Иммунный  ответ - сложный процесс межклеточных взаимодействий лимфоидных клеток различных типов с участием специальных гормонов, в результате чего В-лимфоциты начинают активно синтезировать и выделять в кровь специфические антитела против данного антигена. На поверхности В-лимфоцитов существуют рецепторы, аналогичные антителам, взаимодействие которых с антигеном в сложном межклеточном комплексе служит стимулом для начала биосинтеза антител.

       Получение антител для нужд  человека начинается с иммунизации  животных. После нескольких инъекций  антигена в присутствии стимуляторов  иммунного ответа в сыворотке  крови накапливаются специфические антитела. Антитела выделяют из сыворотки в виде g-глобулиновой фракции, осаждая сыворотку крови сульфатом аммония, спиртом, ПЭГ и другими веществами. Полученные антитела содержат много примесных белков. Высокоочищенные антитела выделяют с помощью ионообменной хроматографии.

     Стандартные препараты получить довольно сложно, так как состав их зависит от вида животного, его индивидуальных особенностей, цикла иммунизации и других малоконтролируемых факторов. Но для современного биохимического анализа очень важна специфичность, то есть способность выделить данное вещество в сложных многокомпонентных средах, таких, как сыворотки крови, сок растений, ферментная среда. Такое возможно при использовании иммунохимического метода, использующего антитела, взаимодействующие узко специфично по принципу "антиген - антитело". Для проведения такого анализа необходимы абсолютно идентичные антитела, синтез которых обычными способами не приемлим.

     Решение проблемы было предложено в 1975 году английскими  учеными Георгом Кёлером и Цезарем Мильштейном. Они разработали методику получения клеточных гибридов - гибридом. Гибридомы образуются в результате слияния лимфоцитов, взятых от иммунизированных животных, с клетками миеломы костного мозга, культивируемыми in vitro.

     Животное  иммунизируют, в ответ на введение антигена в организме мыши активизируются продуцирующие антитела В-лимфоциты. Эти клетки могут жить только в  организме хозяина, при переводе на искусственную питательную среду  они гибнут. Если слить иммунную клетку с опухолевой, образуются гибридные клетки, способные неограниченно долго жить в искусственных средах. Одновременно они сохраняют способность синтезировать антитела.

     Гибридомы, синтезирующие определенные виды антител, отбирают на селективных ростовых средах. Затем их помещают в культуральную жидкость, в которой они размножаются и образуют много родственных клеток (клон). Такие клоны могут синтезировать антитела, получившие название моноклональных (МКА). МКА - антитела, однородные по структуре и специфичности, которые можно производить в неограниченных количествах.

     Другой  метод получения антител основан  на инъекции полученной гибридомы в  брюшную полость мышки. Там гибридома  реплицируется и вызывает образование  асцитной опухоли (скопления клеток, плавающих в жидкости, заполняющей брюшную полость). Асцитная жидкость, выделенная из этой мыши, представляет суспензию, содержащую антитела. Клетки и белки, не относящиеся к МКА, удаляются. Оставшийся материал, представленный преимущественно антителами, используют. Этот метод позволяет получать высококонцентрированные препараты антител. Но массовое производство требует одновременного использования нескольких тысяч мышей. Кроме того, получаемый материал требует доочистки. Это дорого и трудоемко, поэтому в настоящее время предпочтение отдается первому способу, с использованием культуры клеток. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

     4. Методы анализа на основе моноклональных антител 

     Методы  анализа: иммуноферментный (ИФА), иммунолюминесцентный, иммунорадиологический

     Высокая специфичность антител к антигену дает возможность использовать их для идентификации различных веществ (макромолекул, клеточных фрагментов или целых клеток).

     Начало  широкому использованию антител  в диагностических целях положил  в 1955 году американский иммунолог А. Кунс. Он присоединил к антителам светящийся краситель. Флюоресцирующие антитела сделали видимыми места расположения интересующих его молекул в клетке. Этот метод получил название иммунофлюоресцентного. Чувствительность метода можно повысить несколькими путями.

       В первом случае иммунный ответ усиливается за счет применения антител нескольких порядков:

     Антиген иммобилизуется на подложке, к нему добавляются антитела 1-го порядка, связывающиеся непосредственно  с антигеном. В исследуемый образец  добавляются антитела 2-го порядка, связывающиеся с антигенными детерминантами антител 1-го порядка. Антитела 2-го порядка имеют флюоресцирующую (или другую) метку. Поскольку участков связывания может быть несколько, то реакция проявляется более отчетливо.

       Другая система усиления сигнала основана на высоком сродстве биотина (низкомолекулярного растворимого витамина) к стрептавидину (бактериальному белку). Здесь возможны два варианта: 
 
 
 

       А. Если возможно ковалентно связать биотин непосредственно с антителами, то стрептавидин метят маркером и используют аналогично антителам второго порядка:

     Б. Система “биотин-антитело + стрептавидин + меченый биотин”:

     В этом случае образуется целая сеть из молекул стрептавидина, связанного с меченым биотином. Следовательно, происходит многократное усиление сигнала.

       Применение антител второго и  третьего порядков позволяет  упрощать процедуру определения  микроорганизмов в мазке. При этом не обязательно иметь меченые антитела против всех бактерий. Достаточно иметь обычные антитела кролика или мыши против интересующего микроорганизма и меченые МКА против этих иммуноглобулинов. Если микроорганизм в мазке присутствует, то к нему “приклеятся” специфические антитела, а к ним уже - меченые. В результате мазок будет светится при люминесцентной микроскопии. Фотометрические или флуоресцентные методы могут быть использованы не во всех случаях, например, если измерение проводят очень мутной среде.

     Кроме красителя в качестве метки можно  использовать фермент (иммуноферментный анализ) или радиоактивный изотоп (иммунорадиологический). От чувствительности детекции маркера зависит чувствительность метода анализа.