Методы физико-химической биологии в генетике

     Если белковые молекулы поместить в электрическое поле, они начинают перемещаться со скоростью, которая определяется  их суммарным зарядом, а также формой и размерами. В середине 60-х  годов был разработан модифицированный метод электрофореза – электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия. При использовании данного метода белки мигрируют в инертном матриксе – полиакриламидном геле с высоким содержанием поперечных сшивок. Обычно гель готовят полимеризацией  мономеров непосредственно перед использованием. Размеры пор геля могут быть подобраны произвольно с тем, чтобы гель мог замедлить миграцию определённых молекул. При этом белки находятся в растворе, содержащем мощный, отрицательно заряженный детергент – додецил-сульфат натрия. Связываясь с гидрофобными участками белковой молекулы, этот детергент вызывает развёртывание белковых молекул в длинные вытянутые цепи. Каждая молекула белка связывает значительное количество молекул детергента, приобретая суммарный отрицательный заряд. По этой причине белок, после того как будет приложено напряжение, начнёт двигаться в направлении положительного электрода.

     Белки одного размера ведут себя сходным образом, поскольку, во-первых, их природная структура полностью нарушена ДСН так, что их форма идентична, во-вторых, они связывают одинаковое количество ДСН и приобретают одинаковый негативный заряд. Крупные белки, обладающие большим зарядом, подвергаются действию значительных электрических сил. А так же более существенному торможению. В обычных растворах эти эффекты, как правило, взаимно погашаются но в порах полиакриламидного геля, действующего как молекулярное сито, большие молекулы тормозятся значительно сильнее, чем малые, поэтому оказываются ближе к стартовой линии. Смесь молекул делится на ряд полос, расположенных в соответствии с их молекулярной массой.

     Выявить эти полосы можно путём окрашивания соответствующим красителем. Например, белки идентифицируются красителем кумасси синим. Известно, что близко расположенные полосы в геле могут перекрываться. Этот эффект препятствует выявлению большого количества белков (не больше 50) с помощью одномерных методов их разделения.

     Метод гель-электрофореза – это метод, основанный на различной подвижности заряженных частиц, обладающих индивидуальностью: белков, фрагментов ДНК и РНК. Образцы тканей измельчают и выделяют отдельные фракции органических веществ. Каплю раствора, содержащего то, или иное вещество, наносят на поверхность геля. Затем образец помещают в электростатическое поле. Заряженные частицы начинают двигаться в этом поле. Через несколько часов процесс заканчивают, и гель-электрофореграмму проявляют соответствующим реактивом. В результате наблюдают чередование полос, каждая из которых представлена определённой фракцией высокомолекулярного вещества.

     Существует  множество модификаций гель-электрофореза. Например, существует гель-электрофорез при переменной кислотности, при переменном напряжении.

     При двумерном электрофорезе процесс проводят на плоскости. Тогда первоначально полученные фракции расщепляют на фрагменты. Затем электромагнитное поле поворачивают на 90 градусов, и процесс повторяют.

Цитохимические методы

Ряд красочных приемов, направленных на выявление специфических химических веществ, получил название гистохимических и цитохимических. Методов цитохимического анализа очень много.                                        

Существует целый ряд специфических красочных приемов, прямо выявляющих те или иные вещества. Это собственно гистохимические (цитохимические) реакции. Основные требования, предъявляемые к такого рода реакциям, следующие: специфичность связывания красителя, неизменность локализации вещества.

Примером такого рода цитохимических реакций может быть широко применяемая реакция на ДНК, реакция Фёльгена. Суть ее в том, что после специфического кислотного гидролиза только на ДНК в результате отщепления пуринов на дезоксирибозе образуются альдегидные группы. Эти группы могут взаимодействовать со специфическим индикатором , реактивом Шиффа (обесцвеченное основание фуксина), давая красное окрашивание в местах локализации ДНК. Связывание красителя в этом случае строго количественное, что позволяет не только обнаружить и указать места, где есть ДНК, но и измерить ее количество. Используя этот же принцип выявления альдегидных групп, можно в клетках видеть расположение полисахаридов после гидролиза их периодной кислотой (так называемая PAS-реакция).

     Количество конечного продукта цитохимической реакции можно определить с помощью метода цитофотометрии. Основу его составляет определение количества химических веществ по поглощению ими света определенной длины волны. Было найдено, что интенсивность поглощения лучей пропорциональна концентрации вещества при одной и той же толщине объекта. Следовательно, оценивая степень поглощения света данным веществом, можно узнать его количество. Для такого рода исследований используют приборы - микроскопы-цитофотометры; у них за объективом расположен чувствительный фотометр, регистрирующий интенсивность прошедшего через объект светового потока. Зная площадь или объем измеряемой структуры и значение поглощения, можно определить как концентрацию данного вещества, так и его абсолютное содержание. Широко используется метод цитофотометрии при определении количества ДНК на клетку после реакции Фёльгена. В данном случае фотометрируется не сама ДНК, а содержание красно окрашенного фуксина, количество которого прчямо пропорционально содержанию ДНК. Сравнивая полученные величины поглощения со стандартами, можно получить точные значения количества ДНК, выраженные в граммах. Этот метод позволяет измерять количество ДНК до 10-12 - 10-14 г, в то время как микрохимические методы имеют чувствительность не более 10-6 г. С помощью цитофотометрии содержание ДНК в клетках определяется намного точнее обычных биохимических методов.

     Для выявления специфически белков применяют иммунохимические реакции с использованием флуоресцирующих антител. Этот метод иммунофлуоресценции обладает очень большой специфичностью и чувствительностью. Его можно использовать для выявления не только белков, но и отдельных последовательностей нуклеотидов в ДНК или  для определения мест локализации РНК-ДНК гибридных молекул. Для этого сначала на белок (например, тубулин) получают специфические сыворотки, содержащие антитела. Очищенные антитела химически соединяют с флуорохромами. Такие препараты наливают на объекты и с помощью люминесцентного микроскопа по свечению флуорохрома находят места локализации искомых белков в клетке. Однако для того, чтобы  меченные флуорохромами антитела проникли в клетку, необходимо плазматическую мембрану сделать проницаемой. Обычно это достигается фиксацией клеток и частичной экстракцией липидов из мембран. Для изучения с помощью этого метода цитоскелетных белков прибегают к растворению клеточных мембран различными детергентами.

Использованная литература

1)http://postkan.ru/

2)http://biotechnolog.ru/prombt5_6htm

3)http://www.megabook.ru/Article.asp?=623890

4)http://neobio.ru/content/view/12/9/

5)Большая советская энциклопедия

6)http://www.o8ode.ru/article/oleg_me4enyh_atomov.htm

7)Ф. Айала, Дж. Кайгер Современная генетика. Москва «Мир» 1988.

Содержание

Введение

Современные методы генетики

Цитогенетические методы

Выделение и разделение компонентов клетки

Метод авторадиографии

Хроматография

Электрофорез

Цитохимические методы

Использованная литература