Методы физико-химической биологии в генетике

Казанский Федеральный Университет

Тема: «Методы физико – химической биологии в генетике»

Выполнила: Гадельзянова Гульназ 111 группа

Казань 2011

Введение

      Генетика по праву может считаться одной из самых важных областей не только биологии, но и всей науки, оказывающей существенное влияние на жизнь и развитие человечества.

     Первые генетические представления сформировались в связи с сельскохозяйственной и медицинской деятельностью людей. Исторические документы свидетельствуют, что уже 6 тысяч лет назад в животноводстве составлялись родословные, люди уже понимали, что некоторые физические признаки могут передаваться от одного поколения другому. Наблюдения о наследовании повышенной кровоточивости у лиц мужского пола (гемофилия) отражены в религиозных документах, в частности, в Талмуде (4 - % века до н. э.). Передача из поколении в поколение определённых признаков составляет понятие одного из важнейших свойств живого – наследственность.

     Генетика – наука о наследственности и изменчивости организмов. Генетика – дисциплина, изучающая механизмы и закономерности наследственности и изменчивости организмов, методы управления этими процессами. Она призвана раскрыть законы воспроизведения живого по поколениям, появление у организмов новых свойств, законы индивидуального развития особи и материальной основы исторических преобразований организмов в процессе эволюции.

     Объектами генетики являются вирусы, бактерии, грибы, растения, животные и человек.  На фоне видовой и другой специфики в явлениях наследственности для всех живых существ обнаруживаются общие законы. Их существование показывает единство органического мира. История генетики начинается с 1900 года, когда независимо друг от друга Корренс, Герман и де Фриз открыли и сформулировали законы наследования признаков. С того времени генетика в своём развитии прошла три хорошо очерченных этапа – эпоха Классической генетики (1900 – 1930), эпоха неоклассицизма (1930 – 1953) и эпоха синтетической генетики, которая началась в 1953 году. Новый этап в развитии генетики стал возможным благодаря расшифровке структуры «золотой» молекулы ДНК в 1953 году Дж. Уотсоном и Ф. Криком. Генетика переходит на молекулярный уровень исследований. Стало возможным расшифровать структуру гена, определить материальные основы и механизмы наследственности и изменчивости. Генетика научилась влиять на эти процессы, направлять их в нужное русло. Появились широкие возможности соединения теории и практики.

Современные методы генетики

     Совокупность методов исследования наследственных свойств организма (его генотипа) называется генетический анализ.

     В зависимости от задачи и особенностей изучаемого объекта генетический анализ проводят на популяционном, организменном, клеточном и молекулярном уровнях.

     Основу генетического анализа составляет гибридологический анализ, основанный на анализе наследования признаков при скрещиваниях.

     Гибридологический анализ, основы которого разработал основатель современной генетики Г. Мендель, основан на следующих принципах.

1.        Использование в качестве исходных особей, форм, не дающих расщепление при скрещивании, т.е. константных форм.

2.        Анализ наследования отдельных пар альтернативных признаков. т.е. признаков, представленных двумя взаимоисключающими вариантами.

3.        Количественный учёт форм, выщепляющихся в виде последовательных скрещиваний и использование математических методов при обработке результатов.

4.        Индивидуальный анализ потомства от каждой родительской особи.

5.        На основании результатов скрещивания составляется и анализируется схема скрещиваний.

     Гибридологическому анализу обычно предшествует селекционный метод. С его помощью осуществляют подбор или создание исходного материала, подвергающегося дальнейшему анализу (например, Г. Мендель, который по существу является основоположником генетического анализа, начинал свою работу с получения константных – гомозиготных – форм гороха путём самоопыления);

     Однако в некоторых случаях метод прямого гибридологического анализа оказывается неприменим. Например, при изучении наследования признаков у человека необходимо учитывать ряд обстоятельств: невозможность планирования скрещиваний, низкая плодовитость, длительный период полового созревания. Поэтому кроме гибридологического анализа используется множество других методов.

Цитогенетические методы.

     Цитогенетика – это раздел генетики, изучающий видимые носители генетической информации: митотические, мейотические и политенные хромосомы, интерфазные ядра, в меньшей степени – митохондрии и пластиды. Следовательно, цитогенетические методы – это, в первую очередь, методы изучения хромосом: подсчёт их числа, описание структуры, поведение при делении клетки, а также связь между изменением структуры хромосом с изменчивостью признаков.

     Цитогенетические методы заключаются в цитогенетическом анализе генетических структур и явлений на основе гибридологического анализа с целью сопоставления генетических явлений со структурой и поведением хромосом и их участков (анализ хромосомных и геномных мутаций, построение цитологических карт хромосом, цитохимическое изучение активности генов и т. п.). Частные случаи цитогенетического метода – кариологический, кариотипический, геномный анализ.

     Для изучения структуры хромосом и других носителей наследственной информации используются методы электронной микроскопии.

Молекулярно-генетические – биохимические и физико-химические методы

     Молекулярно-генетические – биохимические и физико-химические методы включают разнообразные, направленные на изучение структуры и функции генетического материала и направлен на выяснение этапов пути «ген – признак» и механизмов взаимодействия различных молекул на этом пути.

Выделение и разделение компонентов клетки.

     Для изучения химического состава компонентов клетки необходимо произвести разделение этих компонентов. Первоначально производится грубое измельчение образцов. Затем производится разрушение клеток, например, в шаровых мельницах или растиранием в ступке с кварцевым песком.  Для более полного разрушения клеток используют специальные приборы – гомогенизаторы. Для сохранения первоначального строения внутриклеточных структур все операции производятся на холоду (от 0 до +4С) в растворе сахарозы (обычно 0,25 М).

     Для выделения изолированных клеточных структур используется центрифугирование при ускорении от 600g до 10000g и более. При этом удаётся выделить следующих фракции (начиная от дна центрифужной пробирки): ядра, митохондрии, крупные фрагменты мембран, лизосомы, водорастворимые компоненты. Каждый из компонентов содержит собственные специфические вещества (биохимические маркеры), например, фрагменты плазмалеммы содержат натрий-калиевый переносчик, лизосомы содержат гидролитические ферменты, пероксисомы содержат каталазу и т. д.

Метод меченых атомов (метод авторадиографии)

     Техника меченых атомов приобрела широкую популярность в наше время. Теоретически эта методика очень проста.  По существу, она сводится к введению особого изотопа в биологически важный метаболит (или продукт питания), после чего прослеживаются последовательные реакции этого метаболита в организме путём наблюдения за судьбой меченого изотопа в продуктах распада, крови, моче и т. д. На основании этих данных строится метаболизм. Использование меченых изотопов стало возможным благодаря широкому развитию методов получения изотопов.

     Метод авторадиографии (радиоактивных изотопов) при изучении клетки используют, чтобы обнаружить местонахождение и перемещение в клетках и тканях исследуемых веществ. Метод основан на способности включенных в клетки изотопов с а-, б- или у- излучением восстанавливать бромистое серебро фотоэмульсии. В организм вводят исследуемое вещество, меченое радиоактивными изотопами (3Н, 14С, 32Р и др.).

     Попавшее в клетку радиоактивное вещество испускает электроны, которые воздействуют на бромистое серебро фотоэмульсии, покрывающий  содержимое клетки, в результате чего на месте его нахождения обнаруживается чёрный след или точка. По таким радиоактивным «следам» - афтографам и узнаётся путь передвижения и обмена веществ. Передвижение в организме веществ, меченых радиоактивным кобальтом (60Со), обнаруживают с помощью специальных счётчиков.

      Особенно ценные результаты дало объединение методов скоростного центрифугирования и авторадиографии. Передвижение и действие введённых в организм веществ оказалось возможным изучать в отдельных изолированных мельчайших частицах клетки. С помощью авторадиографии был изучен цикл клеточного митоза и выяснены многие моменты синтеза белков и нуклеиновых кислот.

Хроматография

     Наибольшее распространение получила хроматография. Каплю образца наносят на специальную бумагу или пластинку стекла или пластмассы, покрытую тонким слоем инертного сорбента, например, целлюлозы или силикагеля. Затем такую пластинку одним концом помещают в смесь растворителей (например, воды и спирта).

     По мере движения растворителей по пластинке, они подхватывают те молекулы образца, которые растворяются в них. Растворители выбирают таким образом, чтобы они связывались с сорбентом по-разному. В результате молекулы образца, более растворимые в связанном растворителе, движутся медленнее, а другие, более растворимые в слабо сорбированном растворителе, движутся быстрее. Через несколько часов пластинку сушат, окрашивают и определяют положение различных молекул.

     Можно разделять молекулы методом хроматографии на колонках (колоночная хроматография). В этом случае смесь молекул в растворе пропускают через колонку, содержащую твёрдый пористый матрикс. В результате взаимодействия с матриксом различные  молекулы проходят через колонку с различной скоростью. После того как они достигнут в определённой последовательности дна колонки, их собирают отдельными фракциями.

     В настоящее время разработано и применяется множество матриксов различных типов, используя которые можно делить белки согласно их:

     заряду (ионообменная хроматография),

     гидрофобности (гидрофобная хроматография),

     размеру (хроматография гель-фильтрацией),

     способности связываться различными химическими группами (аффинная хроматография).

     При ионообменной хроматографии нерастворимый матрикс содержит ионы, задерживающие молекулы с противоположным зарядом. Для разделения молекул используются следующие матриксы: диэтиламиноэтилцеллюлоза (ДЭАЭ-целлюлоза) – заряжена положительно; карбоксиметилцеллюлоза (КМ-целлюлоза) и фосфоцеллюлоза – заряжены отрицательно.  Силы взаимодействия между молекулами в растворе и ионообменником определяются ионной силой и рН элюирующего раствора.

     Гидрофобные колонки наполнены шариками, из которых выступают гидрофобные цепи; в таких колонках задерживаютя белки с обнажёнными гидрофобными участками.

     Колонки, предназначенные для гель-фильтрации, заполнены крошечными пористыми инертными шариками; при использовании таких колонок происходит разделение белков по размерам. Молекулы  небольшого размера по мере прохождения через колонку проникают внутрь шариков, а более крупные молекулы остаются в промежутках между шариками. В результате они быстрее проходят через колонку и выходят из неё первыми. В качестве матрикса можно использовать зёрна поперечно сшитого полисахарида.

     Гель-фильтрация обычно используется и для разделения молекул, и для определения их размеров.

     Гораздо более эффективен метод аффинной хроматографии (хроматография по сродству). В основе этого метода лежат биологически важные взаимодействия, происходящие на поверхности  белковых молекул. При аффинной хроматографии используется нерастворимый матрикс, ковалентно связанный со специфичными лигандами (антителами или субстратом ферментов), которые присоединяют определённый белок.

     Связываемые иммобилизированным субстратом молекулы фермента можно элюировать концентрированными растворами субстрата в свободной форме, а молекулы, связанные с иммобилизированными антителами, можно элюировать за счёт диссоциации комплекса антитело-антиген концентрированными растворами соли или растворами низкого или высокого рН. Однократная хроматография на такой колонке позволяет зачастую достигнуть очень высокой степени очистки препарата.

Электрофорез

     Электрофорез – метод разделения белков и нуклеиновых кислот в свободном водном растворе и пористом матриксом, в качестве которого можно использовать полисахариды.  Биомолекулы обычно несут суммарно положительный или отрицательный заряд, обусловленный наличием на их поверхности положительно или отрицательно заряженных групп аминокислот.