Цикл репродукции ретровирусов

 

 

 

 

 

 

 

Реферат

Цикл репродукции  ретровирусов

Оглавление

Введение…………………………………………………………………………………   3

Адсорбция и проникновение…………………………………………………..  4

Синтез неинтегрированной  вирусной ДНК…………………………….  5

Интеграция вирусной ДНК………………………………………………………  10

Экспрессия вирусной ДНК……………………………………………………….  11

Синтез вирусных белков и  сборка вирионов……………………...…… 13

Список использованных источников…………………………..................  16

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Введение

 

Ретровирусы - вирусы с необычным способом репликации генетического материала. Для цикла репродукции этого большого семейства вирусов характерен обратный поток генетической информации: вместо обычной транскрипции (т.е. переписывания) дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) в рибонуклеиновую кислоту (РНК), как это происходит в клетке, их геномная РНК переписывается в ДНК. Эта особенность репродукции ретровирусов отражена в названии: "ретро" значит "обратный".

Члены семейства ретровирусов вызывают ряд тяжелых заболеваний  животных и человека. К наиболее изученным вирусам относятся  вирусы лейкемии птиц, мышей, кошек  и приматов, а также вирусы иммунодефицита кошек, обезьян и человека. Вирус  иммунодефицита человека (ВИЧ) вызвал пандемию ВИЧ-инфекции и СПИДа (синдрома приобретенного иммунодефицита) во всем мире.

Репликативный цикл ретровирусов удобно разделить на 5 стадий:

1. адсорбция, проникновение и «раздевание»;
2. превращение вирусного РНК-генома в полноразмерную неинтегрированную линейную (свободную) ДНК;
3. интеграция вирусной ДНК с хозяйским геномом;
4. экспрессия генов интегрированной вирусной ДНК;
5. синтез вирусных белков и оборка вирионов.

 

 

 

 

 

Адсорбция и проникновение

 

Взаимодействие  вирусов с клетками определяется наличием у них биологического сродства (тропизма), и прежде всего специфических рецепторов. С них и начинается «узнавание» вирусом чувствительных клеток. Находятся они на поверхности наружной мембраны клеток в большом количестве, не менее 10⁴ - 10⁵.

Адсорбция этих и других вирусов на соответствующих рецепторах осуществляется специфическим взаимодействием между поверхностным гликопротеином вируса и рецептором клетки-хозяина. Сведения о способе попадания вириона внутрь клетки противоречивы: неясно, происходит ли проникновение непосредственно через плазматическую мембрану или путем эндоцитоза (виропексиса) (рис. 1).

Рис. 1 Адсорбция и проникновение вируса, формирование комплекса обратной транскрипции [1].

 

Виропексис (греч. pexis - прикрепление) представляет собой своеобразную форму эндоцитоза (греч. endo - внутри и cytus -клетка), при котором вирус проникает в клетку путем впячивания мембраны с образованием вокруг него вакуоли и поэтапным ее слиянием вначале с более крупной цитоплазматической вакуолью, а далее - с лизосомой или же с внутриклеточными мембранами, включая ядерную.

Способность к репродукции вирусы приобретают  только после освобождения их нуклеиновых кислот от оболочек, что принято называть фазой раздевания (депротеинизации). Так или иначе, на первых этапах, заражения вирион переходит в новое состояние, когда он готов начать синтез вирусной ДНК – комплекс обратной транскрипции. В какой степени происходит при этом «раздевание» вирионов, остается неясным.

 

Синтез неинтегрированной  вирусной ДНК

 

Главная задача этого этапа  инфекции — превратить одноцепочечный РНК-геном в линейную двухцепочечную вирусную ДНК. Синтез вирусной ДНК, который идет в цитоплазме и требует, по крайней мере, четырех часов, осуществляется обратной транскриптазой (ревертазой). В ходе этого процесса определенные последовательности, присутствующие в виде уникальных копий в РНК, должны быть дуплицированы, чтобы образовать LTR на обоих концах ДНК-продукта. Поэтому главными участниками второй фазы заражения являются ревертаза, последовательности на концах вирусной РНК и LTR.

Продукты гена pol (обычно называемые ревертазой) обладают, по-крайней мере, тремя ферментативными активностями: ДНК-полимеразной, использующей в качестве матриц как РНК, так и ДНК; активностью РНКазы Н, гидролизующей РНК в составе гибрида РНК — ДНК, и ДНК-эндонуклеазной активностью. Первые две из них необходимы для синтеза свободной вирусной ДНК. Эндонуклеазная активность, вероятно, необходима для интеграции вирусной ДНК с геномом клетки-хозяина. Присутствие ревертазы в вирионе есть необходимое условие инфекциозности. Фермент состоит из двух субъединиц — альфа (α) и бета (β). α-субъединица представляет собой N-концевую часть (две трети) β-субъединицы. Большая субъединица обладает всеми тремя активностями, в то время как меньшая — только полимеразной и активностью РНКазы Н. Эндонуклеазная активность обусловлена С-концевой частью β-субъединицы.

У ретровирусов затравкой для синтеза первой цепи ДНК служит определенная тРНК (триптофановая, пролиновая и лизиновая), З'-концевая часть которой связана с комплементарной ей последовательностью вблизи 5'-конца вирусной РНК.

В первой фазе вирусной репликации непосредственно участвуют несколько областей вирусной РНК. Каждый повтор LTR возникает из трех областей вирусной РНК: последовательностей R, U5 и U3. Последовательность R (от англ. redundant — избыточная) - это короткий участок, дважды присутствующий в составе РНК — на ее левом (5') и правом (3') концах. Последовательность R формирует внутренний участок LTR и играет важную роль на ранних стадиях синтеза ДНК. Следующие за R 80—120 нуклеотидов с 5'-конца РНК называют последовательностью U5. Эта последовательность, присутствующая в составе РНК в виде одной копии, дуплицируется при формировании LTR, где она находится, за R-областью. Расположенная перед R последовательность U3 локализована на З'-конце РНК и также дуплицируется в ходе синтеза ДНК.

18 нуклеотидов, примыкающих  справа к U5 в вирусной РНК, служат участками связывания тРНК, используемой в качестве затравки при синтезе первой цепи ДНК. Короткий богатый пуринами участок (10—20 нуклеотидов), непосредственно предшествующий U3 в вирусной РНК, служит, как полагают, затравкой при инициации синтеза второй цепи ДНК.

На рис. 2 схематично показаны стадии обратной транскрипции:

1. Геном вируса с тРНК, связанной в области PBS;
2. Обратная транскриптаза начинает синтез (-) ДНК на 3’-конце тРНК;
3. РНКаза Н разрезает дуплекс РНК-ДНК и происходит присоединение минус-цепи к R-области на правом конце РНК;
4. Элонгация (-) ДНК;
5. РНКаза Н разрушает РНК в составе гибрида РНК—ДНК, начинается синтез (+) ДНК;
6. Оставшаяся РНК разрушается;
7. (+) ДНК отсоединяется от 5’-конца (-) ДНК и присоединяется к 3’-концу;
8. Завершается синтез обеих цепей ДНК.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Рис. 2 Стадии обратной транскрипции [1].

 

 

Теперь рассмотрим каждый этап более детально. Итак, первым синтезируется фрагмент, который затем станет самой правой частью вирусной минус-цепи ДНК: он начинается с правого конца U5 и заканчивается у конца вирусной РНК — в левой части последовательности R. Эта ДНК ковалентно связана с З'-концом тРНК-затравки, расположенной у правой, границы U5. Достигнув конца РНК, синтез останавливается (первый фрагмент ДНК, включающий U5 и R, называют strong-stop-ДНК).

Чтобы продолжить синтез минус-цепи ДНК, ревертаза в комплексе со strong-stop-ДНК должна «перепрыгнуть» с левого на правый конец вирусной РНК. Этот «прыжок» обеспечивается последовательностью R, строго повторенной на концах РНК, а также активностью РНКазы Н ревертазы. РНКаза Н разрушает R-фрагмент РНК в составе гибрида РНК—ДНК, что позволяет освободившейся минус-цепи ДНК соединиться с комплементарной R-последовательностью на правом конце РНК.

Подготовка к третьему этапу (синтез минус-цепи левого повтора  LTR) начинается еще до завершения второго этапа (элонгация минус-цепи ДНК справа налево). Синтез минус-цепи правого LTR завершается копированием U3-области РНК. РНКаза продолжает разрушать РНК в составе нодосинтезированного гибрида РНК—ДНК. После этого может начаться синтез плюс-цепи ДНК правого LTR, которая будет служить матрицей на третьем этапе репликации — синтезе минус-цепи ДНК. В синтезе плюс-цепи ДНК в качестве матрицы используется минус-цепь ДНК LTR. Затравкой для синтеза плюс-цепи ДНК, вероятно, является вирусная РНК, сохранившаяся к этому моменту около левой границы U3. Хотя эта плюс-цепь ДНК и синтезируется на матрице минус-цепи ДНК правого LTR, в результате она оказывается частью левого LTR. Очень важно отметить, что синтез плюс-цепи ДНК продолжается за LTR и включает образование участка, комплементарного первым 18 нуклеотидам тРНК-затравки, которая продолжает оставаться ковалентно связанной с минус-цепью ДНК; этот участок обеспечивает возможность второго «прыжка» в ходе обратной транскрипции.

Вместе с тем синтез минус-цепи ДНК продолжается справа налево и завершается копированием сайта связывания затравки, поскольку  следующие за ним области U5 и R уже удалены РНКазой Н. На этом завершается второй этап репликации ДНК.

Для начала третьего этапа  синтеза минус-цепи ДНК требуется, чтобы ревертаза вновь сменила матрицу, на этот раз на плюс-цепь LTR. Этот второй «прыжок», вероятно, обеспечивается 18 нуклеотидами фрагмента плюс-цепи, комплементарными тРНК. РНКаза Н, по-видимому, удаляет тРНК, спаренную с плюс-ДНК, после чего «освободившиеся» 18 нуклеотидов спариваются с комплементарным им участком на конце плюс-ДНК. Затем синтезируется минус-цепь левого LTR, которая достраивается до конца и вытесняет минус-цепь правого LTR. Таким образом, плюс-цепь LTR, построенная исходно на правом LTR, оказывается слева. Затем достраивается оставшаяся часть плюс-цепи и в результате возникает тупоконечная линейная двухцепочечная ДНК с повторами LTR на концах.

По сравнению с другими  вирусами, у ретровирусов есть 3 необычных свойства репликации. Во-первых, вирус должен превратить свой РНК-геном в ДНК: Во-вторых, эта ДНК длиннее, чем вирусная РНК. Это удлинение обусловлено удвоением части последовательности вирусной РНК. Дуплицированные последовательности образуют длинные концевые повторы (LTR — long terminal repeat) вирусной ДНК. Само название указывает на то, что удвоенные последовательности расположены на концах провирусной ДНК. Размер LTR составляет от 0,3 до 1,4 kb в зависимости от вида вируса. Большинство последовательностей, образующих LTR, представлены в РНК лишь одной копией и расположены как на 5'-, так и на З'-конце. Третья необычная черта ретровирусной репликации— эффективная интеграция свободной ДНК с геномом клетки в строго определенной ориентации, которая зависит от концевых последовательностей обоих LTR.

 

Интеграция вирусной ДНК

 

Свободные линейные провирусные  ДНК представляют собой предшественники  интегрированных провирусов. Следует  отметить, однако, что процесс интеграции еще мало исследован. Известно, что для его успешного осуществления необходимы концы LTR, поскольку мутанты, утратившие эти последовательности, не способны к интеграции. Интеграция требует также неизвестных клеточных факторов. Кроме того, видимо, необходима эндонуклеазная активность ревертазы, поскольку мутанты с делетированным С-концевым участком ревертазы не способны встраивать свою ДНК в клеточный геном. Вирусная ДНК интегрирует с сохранением ориентации, характерной для свободной линейной провирусной ДНК: LTR-gag-pol-env-LTR. Средняя часть содержит 3 гена: gag – общий антиген, pol – полимераза, env – белок оболочки. Однако в клеточном геноме существует много мест, в которые может встроиться провирус. Последовательности, в которые он встраивается, обычно не содержат гомологии с вирусной ДНК. Более того, у провирусов нет тенденции включаться в уже существующие в геноме последовательности эндогенных или экзогенных ретровирусов. Эти данные свидетельствуют о том, что провирус может внедриться в любое место хозяйской ДНК (рис.3).

Рис. 3 Встраивание провируса  в хромосому клетки [1].

 

При интеграции провирус теряет по 2 концевых нуклеотида с каждого конца, а участок хозяйской ДНК, в который встраивается провирус, дуплицируется. В результате и справа, и слева от включенного провируса находится клеточная нуклеотидная последовательность, которая до интеграции была представлена лишь одной копией.

Часть линейных свободных  молекул вирусной ДНК в ядрах  превращается в ковалентно замкнутые  кольца, но неизвестно, являются ли они предшественниками интегрированных провирусов. Количество кольцевых провирусов нарастает в первые 2—3 дня после заражения и может достигать 100 копий на клетку.

 

Экспрессия вирусной ДНК

 

Провирус является транскрипционной единицей с собственными регуляторными последовательностями. Однако экспрессия конкретного провируса зависит как от вирус-специфических, так и от хозяйских факторов, в частности от места интеграции, физиологического состояния клетки и LTR. В отличие от многих других вирусов у ретровирусов продукты экспрессии генома не участвуют в контроле их экспрессии, а экспрессия провируса зависит только от хозяйских ферментов. Вирус-специфическая регуляция экспрессии осуществляется с помощью LTR, несущих промоторы, энхансер транскрипции, сигналы полиаденилирования. Транскрипция начинается на левом конце последовательности R левого LTR. Как и большинство эукариотических генов, провирусы транскрибируются с помощью клеточной РНК-полимеразы II. Вирусные транскрипты полиаденилируются за правым концом последовательности R правого LTR; сигнал полиаденилирования (обычно ААТААА) расположен внутри R примерно за 20 нуклеотидов перед ее правым концом. Итак, транскрипция начинается за левым, а заканчивается добавлением poly (А)-участка, перед, правым концом провируса. Область U3 всех LTR содержит также ССААТ- и ТАТАА-участки или сходные последовательности, входящие в состав промоторов РНК-полимеразы II и расположенные непосредственно перед началом транскрипции.

Первичным продуктом транскрипции провируса является полноразмерная молекула РНК. Вирусная РНК обычно составляет от 0,1 до 1% тотальной клеточной РНК  и может достигать 20% полиаденилированной  РНК зараженных клеток. У полноценных  вирусов эта РНК, как и ее процессированные варианты, выполняет две главные  функции: формирует вирионную РНК  и служит мРНК для синтеза продуктов  генов gag, pol и env (рис. 4).

Рис. 4 Транскрипция вирусной ДНК [1].

До сих пор не выявлено различий между вирионной РНК  и РНК, которая служит матрицей для  синтеза продуктов gag и pol. Тем не менее времена их полужизни различаются, что указывает на различие их путей метаболизма внутри клетки. Продукт гена pol синтезируется в виде длинного слитного полипротеина gag-pol. С большинства же молекул полноразмерной мРНК транслируется лишь продукт гена gag.