Биопленки: локализация, структура, роль в патологии человека

1.4. Устойчивость к химическим агентам и стрессовым факторам

Следует отметить, что до последнего времени основное внимание уделялось не столько метаболическим различиям планктонных культур и культур, входящих в состав биопленок, сколько различиям их чувствительности к стрессовым факторам [2]. Одна из точек зрения на причину формирования биопленок исходит из того предположения, что эти структурированные сообщества являются способом защиты микроорганизмов от стрессовых условий. Действительно, микроорганизмы в биопленках более устойчивы к различным стрессовым воздействиям: лимитированию субстратами, изменениям рН, окислению активными формами кислорода. Однако наибольшее внимание исследователей привлекает устойчивость биопленок к антибиотикам и различным биоцидам. Это объясняется, в первую очередь, важностью таких исследований для медицины, поскольку многие патогенные микроорганизмы образуют биопленки в инфицированном макроорганизме, а также на поверхности различных изделий, имеющих медицинское назначение (катетеров, глазных линз, искусственных клапанов сердца и др.). по данным разных авторов, не менее 60% инфекций вызывается возбудителями, локализованными в биопленках. Оказалось, что микроорганизмы, входящие в состав биопленок, в отличие от планктонных культур в 100-1000 раз менее чувствительны к большинству антибиотиков и других биоцидных веществ. Природе этой устойчивости посвящено множество работ. Однако в связи с различиями в применяемых методах и экспериментальных деталях самого процесса получения биопленок взгляды авторов на механизмы этой устойчивости варьируют в широких пределах. Большое распространение получили представления о том, что значительную роль в приобретаемой устойчивости играет способность экзополисахаридного матрикса связывать антибиотики. Несомненно, также, что существенный вклад в устойчивость вносят особенности «биопленочного» фенотипа клеток, выражающиеся в избирательной экспрессии генов «устойчивости». К таким генам, в частности, относят «ген-регулятор ответа на аминогликозиды» (arr) у P.aeruginosa, кодирующий мембранную фосфодиэстеразу, субстратом которой, в свою очередь, служит «вторичный мессенджер» - циклический дигуанозинмонофосфат, регулирующий степень адгезивности поверхности бактериальных клеток. Ряд авторов пытались объяснить устойчивость к антибиотикам в биопленках повышенным образованием так называемых «систем множественной устойчивости», основанных на активном удалении (экскреции) антибиотиков из клеток макроорганизма. Однако тщательный анализ не подтвердил это предположение. Как в случае P.aeruginosa, так и в случае C.albicans усиленного образования таких систем не наблюдали. Более того, двойной мутант C.albicans по этим системам, утративший устойчивость к флуконазолу в планктонной культуре, полностью сохранил ее в биопленке. Отсюда следует вполне логичный вывод о том, что устойчивость к антибиотикам (и, вероятно, к другим токсичным агентам) в биопленках представляет собой комплексное явление, которое нельзя полностью объяснить каким-либо одним механизмом.

Многие авторы обращали внимание на тот факт, что в биопленке скорость роста клеток обычно значительно ниже, чем в планктонных культурах. А поскольку известно, что быстро растущие клетки чувствительнее к антибиотикам, чем медленно растущие, низкую скорость роста стали рассматривать как одну из причин, обусловливающих устойчивость к антибиотикам (и ряду других неблагоприятных факторов) в биопленках. Создана математическая модель, основанная на представлении о локальном лимитировании субстрата, приводящем к замедленному росту и предсказывающая существование прямой зависимости между скоростью роста и скоростью гибели клеток под действием антибиотика.

Наибольшее распространение в последнее время получило представление о существовании в биопленках особых «персистируюших» клеток.

Само представление о существовании в популяции бактерий фракции клеток, менее чувствительных к действию ингибиторов, возникло довольно давно, еще на заре эры антибиотиков, тогда же они получили название «персистеры». Наличие таких клеток в составе популяции бактерий подтверждалось неоднократно. Более детальные исследования последних лет показали, что свойства популяции P.aeruginosa в биопленке сходны со свойствами культуры стационарной фазы, а повышенная устойчивость этих популяций к токсичным агентам определяется низкой скоростью размножения и наличием фракции клеток-персистеров. Количество таких клеток в стационарной культуре составляет 1-10%.

Природа клеток-персистеров остается во многом загадочной. Высказано предположение, что персистеры – это специализированные переживающие клетки, возникающие на определенной фазе роста. В стадии логарифмического роста эти клетки присутствуют в незначительном количестве, и они неспособны к делению, поэтому повторные пересевы культуры в этой стадии освобождают популяцию от клеток-персистеров. Полагают, что в клетках-персистерах экспрессируются специфические гены (в частности, ген hipA), действующие по модели «токсин-антитоксин» и блокирующие мишени антибиотиков, что ограничивает рост (переводит клетки в покоящееся состояние), но придает им устойчивость к данным ингибиторам.

Формирование клеток-персистеров можно рассматривать как способ приспособления к меняющимся условиям внешней среды, когда перед популяцией клеток возникает альтернатива выбора стратегии: продолжать размножение с риском погибнуть под влиянием стрессовых условий, либо ценой подавления роста получить «страховку» от гибели путем перехода в покоящееся состояние. Такая точка зрения подтверждена разработкой математических моделей. В пользу этой модели свидетельствуют также данные об участии клеток-персистеров в устойчивости популяции в биопленках не только к антибиотикам, но и к другим бактерицидным агентам: катионам тяжелых металлов, оксианионам металлов.

Нельзя также недооценивать возможность «переживания» микроорганизмов в биопленках за счет образования других покоящихся форм (например, классических эндоспор), а также путем формирования ультрамикробактерий (нанобактерий). Однако масштаб и значение этих процессов пока изучены недостаточно.

Глава 2. Значение биопленок

2.1. Значение биопленок для экологии микроорганизмов и биотехнологии

В последнее время все большее внимание привлекает участие биопленок в процессах, связанных с антропогенным вмешательством в эти системы, а также возможность использования биопленок в биотехнологических процессах [6].

Большую озабоченность вызывает формирование биопленок, малочувствительных к антибиотикам, в процессе хронических инфекций, в частности, кистозного фиброза. Кроме того, нельзя не учитывать, что в природных условиях биопленки могут служить резервуаром, концентрирующим патогенные микроорганизмы, которые, с одной стороны, в этих условиях трудно поддаются дезинфекционным процессам, а с другой стороны, могут быстро приобретать устойчивость к антибиотикам за счет горизонтального переноса генов резистентности.

Большие осложнения вызывает коррозия металлических изделий (в том числе трубопроводов), которая вызывается или ускоряется микроорганизмами, в том числе сульфатвосстанавливающими бактериями. Однако в последнее время получены данные о возможности снижения коррозии в том случае, когда на поверхности стальных изделий формируются биопленки из генетически модифицированных микроорганизмов, способных образовывать как ингибиторы коррозии, так и антибиотики, подавляющие рост бактерий, вызывающих коррозию. Например, показано, что биопленки, которые включают B.brevis, образующую грамицидин, защищают металлы от коррозии в присутствии сульфатвосстанавливающих бактерий.

Биопленки могут выполнять роль агентов биоконтроля в ризосфере растений, особенно в борьбе с грибными и бактериальными инфекциями. Входящий в состав таких биопленок коммерческий штамм B.subtilis образует антигрибные и антибактериальные вещества, защищающие растения от фитопатогенных микроорганизмов.

Все больший интерес вызывает возможность искусственного конструирования биопленок в качестве «биореакторов». В таких системах можно получать новые физиологически активные продукты.

Наконец, способ защиты от поедания простейшими обнаружен у некоторых бактерий – способность к образованию крупных колоний (или агрегатов) в процессе формирования биопленок, которые оказываются недоступными для эндоцитоза. Это свойство может оказаться полезным при микробиологической биоремедиации почв, а также при формировании ассоциаций (биоаугментации) в процессе очистки сточных вод.

В целом, следует отметить, что образование биопленок не всегда учитывается должным образом при оценке роли микробных сообществ в окружающей среде, особенно в местах, подвергаемых антропогенному воздействию. Например, биопленки с участием нефтеокисляющих микроорганизмов формируются примерно на 40 участках, созданных с типичным нефтяным месторождением, включая различные виды обрастаний. Между тем, методы анализа микрофлоры биопленок (в отличие от анализа планктонных культур) в таких сложных системах не всегда адекватно регистрируют ту часть микроорганизмов, которая в них локализована. Между тем точная оценка удельного вклада этих структурированных сообществ необходима как для борьбы с вредным воздействием биопленок, так и для использования их полезных свойств.

2.2. Значение биопленок в патологии человека

Одна из наиболее распространенных форм существования бактерий в естественных условиях является биопленка. Установлено, что свыше 95% существующих в природе бактерий находятся в биопленках. Биопленка — это хорошо организованное, взаимодействующее сообщество микроорганизмов. В природе биопленки распространены повсеместно.

Свыше 60% всех внутрибольничных инфекций происходит в результате деятельности микроорганизмов, находящихся в биопленке [9]. Сообщество микроорганизмов могут размножаться в любом органе человека и вызывать самые различные осложнения течения хронических заболеваний. Биопленки вызывают пародонтит, кариес зубов, инфекции сердечных клапанов и суставных протезов, мочевыводящих путей, муковисцидоз и инфекции, связанные с катетеризацией сосудов (Приложение 4). Это далеко не весь список заболеваний, вызываемых биопленками. Из 50 типов хронических ран, изученных микроскопически, 30 имели признаки формирования биопленки (60%)

В настоящее время в хирургии на первый план ставятся проблемы микробных биопленок, которые размножаются на медицинских имплантантах, катетерах, протезах, сердечных клапанах и технических конструкциях, имплантированных во время операций. Хронические инфекции, имплантированных медицинских устройств, могут вести к развитию сепсиса и смерти пациентов, особенно у лиц с ослабленным иммунитетом, поэтому развитие биопленок на синтетических имплантантах является большой проблемой для их успешного внедрения и эффективного функционирования. Биопленки проходят через фильтры и оседают на трубах, в тоже время не боятся хлористых препаратов. Возможен отрыв целых колоний микроорганизмов, которые свободно попадают в кран, а далее в наш организм.

Формированием биопленок объясняются особенности течения катетер-ассоциированной инфекции [7]. Бактерии попадают в мочевые пути во время установки катетера, через просвет катетера, восходящим путем из уретры. Таким образом, профилактика катетер-ассоциированной инфекции заключается в профилактике катетеризаций, бактериурии и ее осложнений.

В таблице 1 представлены микроорганизмы, часто образующие биопленки в медицинской практике.

Таблица 1 - Микроорганизмы, образующие биопленки в медицинской практике