Биопленки: локализация, структура, роль в патологии человека

Зависимость бактериальной адгезии от рН среды достаточно видоспецифична. Количество адгезированных клеток скользящей бактерии Flexibacter sp. увеличивается со снижением рН. В случае Enterobacter cloacae и Chromobacterium sp. оптимум рН для адгезии находится в области 5,5-7. за пределами этого диапазона количество прикрепленных клеток минимально. Максимальная адгезия P.fluorescens происходит при рН 7. напротив, Archaeoglobus fulgidus образует биопленку при резком повышении рН до экстремальных значений.

Повышение ионной силы раствора усиливает адгезию тогда, когда исходная ионная сила низкая (в растворах с концентрацией менее 0,1 М NaCl). При более высоких значениях этого показателя возможны различные варианты. Так, например, концентрация NaCl до 0,1 М усиливает адгезию Vibrio alginolyticus и P.fluorescens, при превышении этого значения наблюдается ингибирование прикрепления. Повышенная осмолярность среды способствует адгезии Staphylococcus epidermidis.

Влияние температуры на адгезию микроорганизмов также очень видоспецифично. Выделяют два типа зависимости:

1.                      максимальное количество прикрепленных клеток коррелирует с температурным профилем скорости роста, т.е. микроорганизмы прикрепляются в нормальных для роста условиях. Такого рода зависимости демонстрируют представители видов P.fluorescens, E. сloacae и рода Chromobacter

2.                      максимум адгезии наблюдается при неоптимальных, и даже совсем не совместимых с ростом данных микроорганизмов значениях температуры. Повышенная температура вызывает адгезию S. epidermidis. В ответ на температурный стресс A. fulgidus прикрепляются к поверхности культиватора и продуцируют значительные количества хорошо дифференцированной биопленки в течение 2-3 ч.

На бактериальную адгезию могут оказывать влияние концентрация кислорода, а также некоторые яды и ультрафиолетовое излучение.

Создается впечатление, что положительным образом на адгезию (и последующее формирование биопленки), как правило, влияют те факторы, которые в данных условиях рассматриваются микроорганизмом как стрессовые.

Исследовано также влияние на адгезию и биотических факторов.

Фаза роста бактериальной культуры в значительной степени определяет адгезивные свойства клеток. Способность к адгезии анаэробных бактерий Syntrophomonas wolfei и Desulfovibrio наиболее выражена в ранней логарифмической фазе и снижается с возрастом культуры, становясь пренебрежимо низкой при истощении источников питания в среде. Повышенные адгезионные свойства активно растущих клеток могут быть связаны с их подвижностью. Процесс адгезии характеризуется кривой насыщения, достигая максимума через 2 ч. Плотность клеточной суспензии не имеет большого значения. Режим поступления питательных веществ, их качественный состав, а также лимитирование могут быть регулирующими факторами для бактериальной адгезии. Копиотрофные бактерии, помещенные в среду с экстремально низким содержанием источников углерода, т.е. в условия голодания, реагируют на это повышением адгезионных свойств клеток.

В процесс формирования биопленок вовлекается ряд биохимических и генетических механизмов. Специфическим генетическим механизмом можно считать наличие генов, реагирующих на прикрепление и активных только (или в основном) в биопленках. Несколько генов реагируют на обратимое прикрепление, в то время как необратимое прикрепление вызывает изменение активности уже нескольких десятков генов. У Bacillus subtilis образование биопленки регулируется по типу катаболитной репрессии глюкозой. Наличие специфических регуляторных систем биопленкообразования было показано для E.coli, стафилококков, стрептококков.

Ряд авторов отмечают важность наличия поверхностных структур – жгутиков и пилей IV  типа, а также специфических «липких молекул» - лектинов и адгезинов. Адгезины являются специфическими молекулами, обеспечивающими узнавание поверхности, к которой происходит прикрепление, а также само прикрепление за счет гидрофобных, водородных, ионных и ковалентных связей. Эти молекулы, естественно, локализуются на поверхностных структурах микроорганизмов.

Процесс адгезии регулируется также путем образования антиадгезинов, специфических внеклеточных метаболитов, предотвращающих обратимую адгезию. Антиадгезины используются как для регуляции адгезии самого организма-продуцента, так и для борьбы с конкурентами, не допуская их внедрения в уже сформированную биопленку. Так, клетки одного из штамма пленкообразующих морских штаммов скользящих бактерий Cytophaga не подавляют жизнеспособность, но ингибируют адгезию другого штамма за счет выделения ингибитора-гликопротеина, состоящего из 5 нейтральных сахаров и 18 аминокислот.

У P.fluorescens описаны газообразные регуляторы адгезии и антиадгезины, представленные смесью н-алканов, протеазами и другими гидролазами.

Подобное антиадгезионное действие оказывают антиадгезины бацилл, такие как липоциклопептид B.licheniformis, а также хорошо известный биосурфактант сурфактин, выделяемый B. subtilis. Это вещество ингибировало адгезию и формирование биопленки бактериями Salmonella enterica. Выделение биосурфактантов микроорганизмами биопленок как защитный механизм, направленный против колонизации поверхности другими штаммами, впервые было описано на примере пробиотических бактерий в мочеполовой системе, кишечнике и глотке человека. Например, Streptococcus thermophilus и виды рода Lactobacillus в процессе роста способны выделять биосурфактанты.

Межклеточная коммуникация посредством специфических ауторегуляторов чрезвычайно важна для развития и функционирования биопленок. Неспособные к ауторегуляции с участием гомосеринлактонов мутанты P.aeruginosa образовывали нетипичные, вырожденные плоские биопленки. Регуляторы другого типа, галогенфураноны, образуемые морскими водорослями, препятствуют формированию бактериальных биопленок. Известен ряд примеров, когда при истощении источника питания в среде бактерии биопленки выделяют гидролитические ферменты, позволяющие им использовать полимеры матрикса как источники питания и одновременно высвобождающие их в виде планктонных клеток, способных найти более благоприятные для размножения условия. Показано, что выделение сурфактанта рамнолипида P.aeruginosa необходимо для предотвращения плотного прикрепления вновь образованных бактерий внутри биопленки и их удаления из нее, и таким образом, для формирования и поддержания полостей в биопленках.

Активность бактериофагов приводит к лизису части инфицированных бактерий биопленки и появлению полостей и каналов. В старых пленках P.aeruginosa, S.marcescens, Vibrio cholerae и P.tunicata обнаружена индуцированная гибель клеток, за счет которой обеспечиваются пищей оставшиеся клетки и которая способствует структуризации биопленки – образованию полостей, каналов и пор.

Почему в лабораторных условиях микроорганизмы, как привило, растут в виде планктонных культур, а в природе – в виде биопленок? С одной стороны, неспособность к образованию биопленок может явиться результатом отбора, проводимого исследователями и направленного на быстрый рост микроорганизма в виде гомогенной культуры, что облегчает проведение аналитических процедур в динамике роста, получение стандартной биомассы, выделение клеточных компонентов. Хотя в учреждениях, где изучают процессы, осуществляемые прикрепленными или агрегированными культурами (например, при очистке воды), их стараются поддерживать именно в нативном, агрегированном состоянии.

С другой стороны, в лабораторных условиях микроорганизмы стараются выращивать на богатых средах в оптимальных условиях и, возможно, это как раз и есть основная причина роста в виде планктонной культуры.

1.3. Многообразие взаимоотношений между компонентами биопленок

Метаболическая гетерогенность микроорганизмов в биопленках обусловлена многими причинами, из которых наиболее очевидной является пространственная: локализация микробных клеток в различных участках трехмерного матрикса [4]. В этом отношении биопленки принципиально не отличаются от стратифицированных морских и пресноводных осадков. Однако, учитывая меньшую, как правило, толщину биопленок стратифицированные процессы в них обычно выражены не столь заметно.

Тем не менее, с использованием микросенсоров показано, что предпочтительная последовательность акцепторов электронов, присущая осадкам, сохраняется и в пресноводных биопленках. Такие акцепторы располагаются в порядке, соответствующем величине изменения свободной энергии в реакции их восстановления:

O2>NO3(-)>MnO2>Fe(3+)>SO4(2-)>CO2. Поэтому, в первую очередь, используется O2 (в процессах дыхания, нитрификации и окисления сульфида), затем NO2(-) и NO3(-), образованные в процессе нитрификации или поступившие из окружающей среды. Денитрификация может быть сопряжена с окислением сульфида. Сульфатредукция протекает ниже зоны денитрификации. Наконец, метаногенез пространственно отделен от сульфатредукции и осуществляется в наиболее глубоких зонах биопленки.

В целом распределение функций в биопленке можно в упрощенном виде представить следующим образом (Приложение 3).

Однако такая стройная и логически обоснованная модель реализуется далеко не во всех случаях. Микрозональность биопленок приводит к тому, что, например, сульфатредуцирующие бактерии могут располагаться не только на границе аэробной и анаэробной зон, но встречаются даже в анаэробных участках, и при этом активно метаболизируют пропионат.

Поскольку биопленки, как правило, представляют собой гетерогенные сообщества, состоящие из микроорганизмов разных физиологических групп, необходимо остановиться на основных типах взаимоотношений (прежде всего трофических), возникающих между их компонентами.

Взаимодействие между компонентами начинается уже в процессе формирования биопленки. Многократно было показано, что биопленки, состоящие из микроорганизмов разных таксонов, прочнее и толще, чем биопленки, состоящие из микроорганизмов одного вида. Взаимодействие происходит, по-видимому, на стадии формирования внеклеточного матрикса.

В «зрелых» биопленках, в отличие от планктонных культур, конкуренция между видами обнаруживается редко. И даже в том случае, когда один из видов, благодаря более высокой скорости роста занимает господствующее положение, второй сохраняет жизнеспособность и высокую численность. Подобные взаимоотношения обнаружены, например, в бинарных (состоящих из культур двух видов) биопленках между популяциями быстро растущей культуры Klebsiella pneumoniae и культурой P.aeruginosa.

Более редкая разновидность конкуренции – амменсализм может быть обусловлен образованием одним из микроорганизмом агентов, ингибирующих других членов сообщества, а также созданием неблагоприятных физико-химических условий (например, величины рН). Такая ситуация обнаружена в бинарной биопленке, сформированной двумя видами Ruminococcus, один из которых образует бактерицин, активный против другого вида.

Наиболее часто встречающимися взаимоотношениями между микробными компонентами биопленок являются комменсализм и протокооперация.

Комменсализм выражается в одностороннем влиянии одного из компонентов биопленки на жизнедеятельность другого ее компонента. Обычный пример – потребление кислорода аэробным микроорганизмом, способствующее росту микроаэрофильных или анаэробных «сожителей». Этот тип взаимодействия играет важную роль в микробной коррозии с участием сульфатредукторов, локализованных в анаэробных микронишах.

Протокооперация приводит к взаимному положительному влиянию компонентов биопленок друг на друга. Такие взаимоотношения существуют, например, в биопленках, содержащих фототрофные и гетеротрофные микроорганизмы. Характерным примером протокооперации служит также взаимодействие целлюлолитических бродильщиков и метаногенов. Последние, утилизируя молекулярный водород, а также формиат, образованные в процессе брожения, сдвигают термодинамическое равновесие, предотвращая накопление восстановленных коферментов в клетках бродильщиков и стимулируя синтез ими АТФ.

Предыдущий случай является примером, когда протокооперация переходит в синергизм, поскольку оба компонента биопленки получают выгоду от сотрудничества, а образование или потребление какого-либо продукта в биопленке превышает величину, характерную для индивидуальных популяций. Типичным примером служит гидролиз целлюлозы в биопленке, содержащей как целлюлолитические, так и неспособные к расщеплению целлюлозы микроорганизмы. Последние стимулируют гидролиз целлюлозы и рост целлюлолитиков путем потребления низкомолекулярных продуктов гидролиза, которые репрессируют биосинтез целлюлаз.

Заметную роль в межклеточных взаимодействиях в биопленках играет обмен генетической информацией, что в определенной степени обусловлено высокой плотностью микробной популяции. Существует множество доказательств того, что горизонтальный перенос генов в биопленках происходит с большей интенсивностью, чем в планктонных культурах. В биопленках, в частности, реализуется механизм защиты плазмид от элиминирования по типу «токсин-антитоксин». Принцип такой защиты состоит в кодировании плазмидой стабильного белка-токсина и лабильного белка-антитоксина. Если дочерние клетки после деления не содержат плазмид и не способны осуществлять ресинтез антитоксина, то после распада остаточного антитоксина стабильный токсин убивает такие клетки. Эффективность горизонтального переноса генов in situ убедительно доказана применением сканирующей конфокальной лазерной микроскопии (SCLM) с помощью генов-репортеров, кодирующих флуоресцирующие белки: зеленый, красный, голубой, желтый и синий. Более того, удается не только определить пространственную локализацию мигрирующих плазмид в популяции, но и изолировать соответствующую субпопуляцию методами сортирования клеток.

Кроме метаболической гетерогенности, присущей биопленке как целостной системе и определяемой зональностью биопленок, отмечают также существенные особенности в физиолого-биохимических свойствах клеток, входящих в состав биопленок, по сравнению с их планктонными аналогами. В результате возникло представление об особом «биопленочном» фенотипе, выражающемся, в частности, в снижении чувствительности к антибиотикам и токсичным агентам.

Анализ активности отдельных генов, осуществляемый методами «протеомики» (с использованием двухмерного электрофореза белков), позволил установить различия в экспрессии генов в процессе формирования биопленок, а также по мере их созревания. Удалось даже пространственно локализовать места синтеза отдельных белков в биопленке. Так, например, показано, что гены lasI и rhlI P.aeruginosa, определяющие синтез факторов «quorum sensing», преимущественно экспрессируются в клетках, локализованных на границе раздела твердой и жидкой фаз, причем экспрессия первого гена уменьшается со временем, тогда как второй ген экспрессируется с постоянной скоростью.