Апоптоз

Апоптоз

Апопто́з (від дав.-гр. απόπτωσις — опадання) — найбільш розповсюджений тип запрограмованої клітинної смерті. Іншими словами — це сукупність клітинних процесів, що призводять до загибелі клітини. На відміну від іншого виду клітинної смерті — некрозу — при апоптозі не відбувається руйнування цитоплазматичної клітинної мембрани і, відповідно, вміст клітини не потрапляє в позаклітинне середовище. Характерною ознакою є фрагментація ДНК у міжнуклеосомальних ділянках специфічною ендонуклезою — CAD (caspase activated DNase) на фрагменти з розміром, кратним 180–200 нуклеотидам. В результаті апоптозу відбувається утворення апоптичних тілець — мембранних везикул, які містять цілісні органели і фрагменти ядерного хроматину. Ці тільця поглинаються сусідніми клітинами чи макрофагами в результаті фагоцитозу. Так як позаклітинний матрикс не уражається клітинними ферментами, навіть при великій кількості апоптозних клітин, запалення не спостерігається.

Процес апоптозу є необхідним для фізіологічного регулювання кількості клітин організму, для знищення старих клітин, для формування лімфоцитів, що не є реактивними до своїх антигенів (аутоантигенів), для осіннього опадання листків рослин, для цитотоксичної дії Т-лімфоцитів кіллерів, для ембріонального розвитку організму (зникнення шкірних перетинок між пальцями у ембріонів птахів) та іншого.

Порушення нормального апоптозу клітин призводить до неконтрольованого розмноження клітини і появи пухлини.

1.Значення апоптозу

Апоптоз — невід'ємна частина життєдіяльності більшості багатоклітинних організмів. Особливо важливу роль він відіграє у процесах розвитку. Наприклад кінцівки чотириногих закладаються як лопатоподібні вирости, а формування пальців відбувається завдяки загибелі клітин між ними. Також підлягають апоптозу більше не потрібні клітини, таким чином зокрема руйнується хвіст у пуголовків під час метаморфозу. У нервовій тканині хребетних під час ембріонального розвитку більше половини нейронів гинуть шляхом апоптозу відразу ж після утворення[2].

Також апоптоз є частиною системи контролю за «якістю» клітин, він дозволяє руйнувати ті з них, які неправильно розташовані, ушкоджені, нефункціональні або потенційно небезпечні для організму. Прикладом можуть бути T- та B-лімфоцити, які гинуть, якщо не несуть корисних антиген-специфічних рецепторів або несуть автореактивні. Шляхом апоптозу також помирає більшість лімфоцитів аткивованих під час інфекції після її подолання[2].

У дорослих організмів одночасна  регуляція проліферації клітин та апоптозу дозволяє підтримувати сталі розміри цілої особини та її окремих органів. Наприклад, після вживавання препарату фенобарбітал, що стимулює проліферацію гепатоцитів, у пацюків збільшується печінка. Проте, відразу ж після припинення дії цієї речовини всі зайві клітини підлягають апоптозу, внаслідок чого розмір печінки повертається до нормального[3].

Також апоптоз відбувається, коли клітина «відчуває» велику кількість внутрішніх ушкоджень, які вона не може репарувати. Наприклад у разі пошкодження ДНК клітина може трансформуватись у ракову, щоб цього не сталось вона, за нормальних умов, «покінчує життя самогубством». Також гине шляхом апоптозу велика кількість клітин інфікованих вірусами.

2 Маркери апоптозу

Виявлення фрагментації ДНК  в апоптичних клітинах методом TUNEL Препарат тканини печінки миші, ядро апоптичної клітини має коричневе забарвлення, оптична мікроскопія.

Виявлення фрагментації ДНК  в апоптичних клітинах за допомогою електрофорезу в агарозному гелі. Зліва: ДНК виділена із апоптичних клітин — видно «драбинку ДНК»; посередині: маркери; справа: контрольний зразок ДНК із необроблених клітин. Клітинна лінія H4IIE (гепатома щурів), індуктором апоптозу - паракват, візуалізація за допомогою етидій броміду.

Клітини, що гинуть шляхом апоптозу, можна розпізнати за рядом морфологічних ознак. Вони стають меншими і більш щільними (пікноз), округлюються та втрачають псевдоподії, в них руйнується цитоскелет, розпадається ядерна мембрана, хроматин конденсується і фрагментується. На поверхні клітин з'являється велика кількість пухирців, якщо клітини достатньо великі, то вони розпадаються на оточені мембранами фрагменти — апоптичні тільця[5][6].

В апоптичних клітинах крім морфологічних відбувається також велика кількість біохімічних змін. Зокрема ДНК розрізається спеціальними нуклеазами у лінкерних ділянках між нуклеосомами на фрагменти рівної довжини. Тому при розділенні всієї ДНК апоптичної клітини за допомогою електрофорезу можна спостерігати характерну «драбинку». Інший метод виявлення фрагментації ДНК — мічення її вільних кінців за допомогою методу TUNEL (Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling)[3].

Змін зазнає також і  плазматична мембрана апоптичних клітин. За нормальних умов негативно заряджений фосфоліпід фосфатидилсерин міститься тільки в її внутрішньому (повернутому до цитозолю) шарі, проте під час апоптозу він «перескакує» у зовнішній листок. Ця молекула слугує сигналом «з'їж мене» для ближніх фагоцитів. Фосфатидилсерин-індуковане поглинання апоптичних клітин, на відміну від інших типів фагоцитозу, не призводить до виділення медіаторів запалення. Описана зміна плазмалеми лежить в основі ще одного методу виявлення клітин, що гинуть шляхом апоптозу — фарбування анексином V, що специфічно зв'язується із фосфатидилсерином[3].

Під час загибелі клітин шляхом апоптозу вони також втрачають електричний потенціал, що за нормальних умов існує на внутрішніх мембранах мітохондрій. Це явище можна використати для виявлення апоптичних клітин за допомогою позитивно заряджених флуоресцентних барвників, що в нормі накопичуються всередині мітохондрій завдяки негативному заряду на внутрішній поверхні їхніх внутрішніх мембран. Під час апоптозу рівень зафарбовування мітохондрій суттєво знижується. Маркером апоптозу також слугує вивільнення цитохрому c із мітохондрій у цитозоль.

3 Каспаза

Клітинні системи, що забезпечують проходження апоптозу, аналогічні у всіх тварин, центральне місце в них займає родина білків каспаз. Каспази — це протеази, що мають в активному центрі залишок цистеїну, і розрізають свої субстрати по специфічному залишку аспарагінової кислоти (звідси назва: c від cysteine і asp від aspartic acid). Каспази синтезуються в клітині у вигляді неактивних прокаспаз, які можуть ставати субстратами для інших, вже активованих каспаз, що ріжуть їх в одному або двох місцях по залишку аспартату. Два утворені фрагменти — більший і менший — з'єднуються між собою, формуючи димер, що асоціює із таким самим димером. Сформований таким чином тетрамер і є активною протеазою, що може розрізати білки-субстрати. Крім ділянок, що відповідають більшій і меншій субодиницям, прокаспази інколи також містять інгібіторні продомени, які деградують після відщеплення[7].

Внаслідок розщеплення й  активації одних каспаз іншими формується протеалітичний каскад, який суттєво посилює сигнал і робить апоптоз із певного моменту незворотним процесом. Ті прокаспази, які розпочинають цей каскад називаються ініціаторними, а їхні сусбтрати — ефекторними. Після аткивації ефекторні каспази можуть розщеплювати інші ефекторні прокаспази або білки-мішені. До мішеней ефекторних каспаз, що руйнуються під час апоптозу належать зокрема білки ядерної ламіни, розщелення яких призводить до розпаду цієї структури. Також деградує білок, що за нормальних умов пригнічує ендонуклеазу CAD, внаслідок цього розпочинається фрагментація ДНК. Розщеплюються каспазами і білки цитоскелету та міжклітинної адгезії, внаслідок чого апоптичні клітини округлюються і від'єднуються від сусідніх клітин, і таким чином стають легшою мішенню для фагоцитів[8].

Набір каспаз, необхідний для проходження апоптозу залежить від типу тканини і шляху, за яким активується клітинна смерть. Наприклад у мишей при «вимкненні» гену, що кодує ефекторну каспазу-3, апоптоз не відбувається у мозку, проте нормально протікає в інших тканинах[8].

Гени прокаспаз активні у здорових клітинах, а отже білки необхідні для протікання апоптозу постійно наявні, потрібна лише їх активація для запуску клітинного суїциду. До складу ініціаторних прокаспаз входить довгий продомен, що містить CARD (caspase recruitment domain, домен залучення каспаз). CARD дає змогу ініціаторним прокаспазам приєднуватись до адаптерних білків утворюючи активаційні комплекси, коли клітина отримує сигнал, що стимулює апоптоз. В активаційних комплексах кілька молекул прокаспаз опиняються безпосередньо поблизу одне одної, чого достатньо для їх переходу в активний стан, після чого вони розрізають одна одну[8].

Два найкраще вивчені сигнальні  шляхи активації каскаду каспаз у клітинах ссавців називаються зовнішній і внутрішній (мітохондріальний), кожен із них використовує власні ініціаторні прокаспази[8].

4.Шляхи активації апоптозу

Зовнішній шлях

Клітина може отримувати сигнал, що індукує апоптоз, іззовні, наприклад, від цитотоксичних лімфоцитів. В такому разі активується так званий зовнішній шлях (extrinsic pathway), що починається із рецепторів смерті. Рецептори смерті — це трансмембранні білки, що належать до родини рецепторів фактора некрозу пухлин (ФНП), наприклад сам рецептор ФНП і рецептор смерті Fas. Вони формують гомотримери, в яких кожен мономер має позаклітинний ліганд-зв'язувальний домен, трансмембранний домен і цитоплазматичний домен смерті, що через адаптерні білки залучає та активує прокаспази[9].

Ліганди рецепторів смерті також є гомотримерами. Вони споріднені між собою і належать до родини сигнальних молекул фактора некрозу пухлин. Наприклад, цитотоксичні лімфоцити несуть на своїй поверхні ліганди Fas, що можуть приєднуватись до рецепторів смерті Fas на плазмалемі клітин-мішеней. В такому разі внутрішньоклітинні домени цих рецепторів з'єднуються із адаптерними білками (FADD, Fas-associated death domain), а ті у свою чергу залучають ініціаторні прокаспази 8 і/або 10. Внаслідок цієї серії подій формується сигнальний комплекс, що індукує смерть, — DISC (death inducing signaling complex). Після активації в цьому комплексі ініціаторні каспази розрізають ефекторні прокаспази і запускають апоптичний каскад[9].

Багато клітин синтезують молекули, що у певній мірі захищають  їх від активації зовнішнього  шляху апоптозу. Прикладом такого захисту може бути експресія так званих рецепторів-приманок (decoy receptors), що мають позаклітинні домени зв'язування лігандів, проте не мають цитоплазматичних доменів сметрі, а отже не можуть запускати апоптозу і конкурують зі звичайними рецепторами смерті за ліганди. Клітини також можуть продукувати білки, що блокують зовнішній шлях апоптозу, наприклад FLIP, що схожий за структурою до прокаспаз 8 і 10, проте не має протеалітичної активності. Він пригнічує зв'язування ініціаторних прокаспаз із комплексом DISC[9].

Внутрішній  шлях

 Апоптосома

Апоптоз також може запускатись ізсередини клітини, наприклад у випадку її травмування, пошкодження ДНК, нестачі кисню, поживних речовин або позаклітинних сигналів виживання. У хребетних цей сигнальний шлях називається внутрішнім (intrinsic pathway) або мітохондріальним, ключовою подією в ньому є вивільнення певних молекул із міжмембранного простору мітохондрій. До таких молекул зокрема належить цитхром c, що за звичайних умов входить до електрон-транспортного ланцюга мітохондрій, проте у цитоплазмі виконує іншу функцію — приєднується до адаптерного білка Apaf (apoptotic protease actiuating factor-l), викликаючи його олігомеризацію у колесоподібну семичленну структуру, що називається апоптосомою. Апоптосома залучає і активує ініціаторну прокаспазу-9, яка після цього може активувати ініціаторні прокаспази[10].

У деяких клітинах зовнішній  шлях апоптозу повинен активувати внутрішній для того щоб ефективно знищити клітину. Внутрішній шлях строго регулюється білками родини Bcl-2[10].

5.Регуляція внутрішнього шляху білками родини Bcl-2

Родина  білків Bcl-2

До родини Bcl-2 належать еволюційно консервативні білки, головною функцією яких є регуляція вивільнення цитохрому c та інших молекул із міжмебранного простору мітохондрій. Серед них є про-апоптичні та анти-апоптичні молекули, які можуть взаємодіяти між собою у різних комбінаціях, пригнічуючи одне одного, баланс між їхньої активністю і визначатиме долю клітини[11].

Зараз відомо близько 20 білків із цієї родини, всі вони містять  хоча б один із чотирьох альфа-спіральних доменів гомології Bcl2, що звуться BH1—4 (bcl2 homology). Антиапоптичні білки родини Bcl2 містять всі чотири домени, до них належить сам Bcl-2, а також Bcl-XL, Bcl-w, Mcl-1 та A1. Проапоптичні білки діляться на дві групи, члени першої із яких містять три BH-домени (BH1—3), це зокрема Bak, Bax і Bok (останній експресується тільки у тканинах репродуктивних органів). Найбільш численною серед родини Bcl-2 є друга група проапоптичних білків, які містять тільки домен BH3 (BH3-only), до неї належать Bim, Bid, Bad, Bik/Nbk, Bmf, Nix/BNIP3, Hrk, Noxa, Puma[12].

За нормальних умов (тобто, коли клітина не проходить апоптозу) антиапоптичні білки, такі як Bcl-2 і Bcl-XL, зв'язуються із проапоптичними білками BH123 (Bax і Bak) і не дозволяють їм полімеризуватись у зовнішній мембрані мітохондрій утворюючи пори. Внаслідок дії певного апоптичного стимулу в клітині активуються або починають синтезуватись проапоптичні білки, що містять тільки домен BH3. Вони у свою чергу інгібують антиапоптичні білки, знімаючи їх пригнічувальний ефект на Bak і Bax, або напряму взаємодіють із останніми і сприяють їх олігомеризації та утворенню пор. Внаслідок пермеабілізації зовнішньої мембрани у цитозоль потрапляє цитохром c[11], а також інші медіатори апоптозу, такі як AIF (англ. apoptosis inducing factor).

Наприклад, за браку сигналів виживання у клітині за посередництва MAP-кінази JNK активується експресія BH3 білка Bim, що запускає внутрішній шлях апоптозу. У разі ушкодження ДНК відбувається накопичення супресора пухлин p53, який стимулює транскрипцію генів, що кодують BH3 білки Puma і Noxa, які також забезпечують проходження апоптозу. Ще один BH3 білок — Bid забезпечує зв'язок між зовнішнім та внутрішнім шляхами апоптозу. Після активації рецепторів смерті і, як наслідок, каспази-8, остання розрізає Bid з утворенням усіченої форми tBid (truncated Bid), яка переміщується до мітохонрій, де пригнічує Bcl-2 

6.Коррекционное  додавання гена 

Всі онкологічні захворювання прийнято поділяти на p53-залежні і p53-незалежні, оскільки більшість випадків захворювання раком опосередковано мутаціями  в гені p53 . Білок р53 є відомий  пухлинний супресор, основна функціяякого полягає в підтримці стабільності геному. Він бере участь в регуляції клітинного циклу, у виправленні виникають дефектів ДНК і в апаптозе - запрограмованої клітинної загибелі. Вплив на клітину факторів, що викликають зміни в структурі ДНК, таких як ультрафіолетове випромінювання, іонізуюча радіація і різні хімічні речовини, призводить до активації білка p53 який індукує або арешт клітинного циклу, необхідний для виправлення виниклих дефектів ДНК (репарацію), або запускає механізм апоптоза . З цієї причини мутації в гені p53 можуть призводити до неконтрольованої клітинної проліферації і до мутагенезу, опосредуя виникнення і прогресію злоякісного новоутворення.