Анаэробные азотфиксирующие бактерии рода Clostridium

     Азотфксирующую  активность культур Clostridium изучали на забуференой среде Виноградского со стартовой дозой азота 4 мг/л. В качестве стратовой дозы азота использовали пептон определенной марки. Среда содержала минеральную основу (МО) – 1000 мл, глюкозу – 1%, CaCO₃ – 0,5%, пептон – 0,026 г/л, микроэлементы по Федорову – 1 мл/л. В качестве rH₂- индикатора добавляли нейтральрот в концентрации 0,004%. Установили pH среды для Cl. pasteurianum – 5,8; Cl. acetobytylicum – 5,8; Cl. butyricum – 7,4 и Cl. butylicum – 5,7. Опыты ставили в колбах Эрленмейера на 100 мл, Куда наливали по 50 мл питательной среды. Среду инокулировали 1-3 мл бактериальной взвеси. Cl. pasteurianum инкубировали при 27^о, Cl. acetobytylicum – при 37^о, Cl. butyricum – при 30^о, и Cl. butylicum – при 35^о. Азот определяли по микрометоду Кьельдаля. (Емцев, 1974)

     Это метод количественного определения азота в органических веществах, принцип которого заключается в том, что:  1. Весь азот органического вещества при помощи нагревания с крепкой серной кислотой и катализатором переводится в сернокислый аммоний, причем само органическое вещество разрушается совершенно (т. н. окисление, сжигание вещества); при этом углерод переходит в С0₂, водород — в воду, азот же восстанавливается в аммиак.  2. Из полученного раствора после подщелачивания отгоняется аммиак, который поглощается отмеренным, заведомо избыточным объемом титрованной кислоты (перегонка аммиака). 3. Оставшаяся не связанной с аммиаком кислота оттитровывается обратно щелочью и путем вычитания узнается количество связанной с аммиаком титрованной кислоты, следовательно, количество аммиака или азота. (http://bigmeden.ru/article/Кьельдаля_Способ)

     Опыты проводили в пятикратной повторности. В двух повторностях определяли сахар по методу Бертрана. (Емцев, 1974)

     Чтобы решить вопрос о том, на какие сутки  следует определять азотфиксирующую активность Clostridium, был поставлен рекогносцировочный опыт с коллекционным штаммом Cl. pasteurianum 0146. Азотфиксацию определяли, начиная с 36 час. И кончая 480 час. Через двое суток азотфиксация достигала 1 мг азота на 100 мл среды, а через 10 суток она дала максимальный показатель. Исходя из этих данных, в дальнейшей работе азотфиксация определялась через 10-12 суток. (Емцев, 1974)

     Азотфиксирующая способность Cl. pasteurianum и Cl. acetobytylicum, выделенных из разных типов почв Грузии, показана ниже в таблице 1. Наибольшей азотфиксирующей активностью обладали штаммы Cl. pasteurianum из горно-луговой почвы. Интенсивность азотфиксации у штаммов Cl. pasteurianum, выделенных из горного чернозема, лесного бурозема и лесной коричневой почвы, постепенно падала по мере перехода от высокогорных почв к почвам подножия гор. (Емцев, 1974)

     Азотфиксирующая активность штаммов Cl. acetobytylicum, выделенных из различных почв, отличалась незначительно; активность штаммов Cl. butyricum уменьшалась с севера на юг (табл. 2), т.е. здесь наблюдалась та же закономерность, что и у культур Cl. pasteurianum. (Емцев, 1974)

     Существенных  различий в азотфиксирующей активности штаммов Cl. butylicum, выделенных из разных почв, не обнаружено. (Емцев, 1974) 
 

     Таблица 1. (Емцев, 1974) 

       
 
 
 

     Таблица 2. (Емцев, 1974) 

       

     Таким образом, изучение интенсивности фиксации молекулярного азота Clostridium, выделенных из различных типов почв показало, что под влиянием географических условий их активность изменяется, причем в большей степени у Cl. pasteurianum и Cl. butyricum, чем у Cl. acetobytylicum и Cl. butylicum. Штаммы Clostridium, выделенные из дерново-подзолистой и горно-луговой почв, как правило, обладают большей азотфиксирующей активностью, чем штаммы из каштановой почвы и серозема. (Емцев, 1974) 
 
 

4. Влияние внешних факторов на активность анаэробных азотфиксаторов в  почвах.

     Аэробные  азотфиксирующие бактерии живут  в непрерывном взаимодействии с  внешней средой, в которой они  находятся, поэтому подвергаются разнообразным  влияниям. На активность и формирование сообществ азотфиксаторов влияет ряд  природных и антропогенных факторов, таких как температура почвы, ее влажность, воздушный режим почвы, кислотность, механические свойства. (Емцев, Мишустин, 2005)

     Температура почвы

     Температура почвы определяется географическим фактором и сезоном года. В одной  и той же зоне температурный режим  зависит от ее способности поглощать  тепловые лучи, теплоизлучения, от характера  растительности и т.д. (Емцев, 1974)

     Влажность.

     Установлено, что процессы аммонификации и  нитрификации лучше всего протекают  при влажности почвы, равной 60%ПВ. Оптимум фиксации азота несколько  сдвинут в сторону более высокой  влажности. При относительной влажности  окружающей среды ниже 30% жизнедеятельность  большинства азотофиксаторов прекращается. (Мишустин, Емцев, 1987)

     Аэрация почвы.

     Азотофиксирующие  микроорганизмы хорошо переносят повышенное содержание в воздухе CO2. Нередко при этом отмечается даже улучшение их роста, тем не менее при 1-1,5% и более активность некоторых групп азотофиксаторов подавляется. (Мишустин, Емцев, 1987)

     Для роста бактерии нуждаются в элементах  минерального питания, особенно в фосфоре  и кальции. Потребность азотобактера в данных элементах столь высока, что его используют как биологический  индикатор на наличие фосфора  и кальция в почве. Для энергичной азотфиксации микроорганизмам требуются  микроэлементы, из которых наиболее важен молибден, который входит в  состав ферментов, катализирующих процесс  усвоения азота. Отмеченные физиологические  особенности характеризуют экологию данного организма. Азотобактер  обитает в высокоплодородных, достаточно влажных почвах с нейтральной  или близкой к ней реакции  среды. При недостаточной влажности  большинство клеток отмирает. В черноземных, каштановых и сероземных почвах, благоприятных  для рассматриваемого организма, его  обнаруживают в значительных количествах  только весной. При летнем иссушении  почвы остаются единичные клетки. В зоне подзолистых и дерново-подзолистых  почв азотобактер можно найти  в огородных и пойменных почвах, богатых органическими соединениями, с оптимальным рН 6,8...7,2. (Емцев, 2005) 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

3. Практическая  часть.

1. Объекты и методы исследования.

1. Объекты

В качестве объектов в данной курсовой работе использовались три разновидности  дерново-подзолистых почв:  

     Тяжелая суглинистая на моренных суглинках, отобранная с опытного поля всероссийского института кормов им. Вильямса (станция  Луговая, г. Лобня Московской области)

     Тяжелая суглинистая на моренных суглинках, загрязненная тяжелыми металлами (свинец, кадмий, цинк) в дозах, в 100 раз превышающих ПДК для почвы. Почва инкубировалась при температура 25, 30^о С в течение года

Дерново-подзолистая  среднесуглинистая огородная почва, Д^пп Сл М Пс ; Ап 0-22/22; гумус -2,53%;

V% -7,3; НГ-2,3; N-260; K-340; P-310; рН-5,46. 

     2.2 Методы биологического исследования почвы (подготовка почвы к анализу и проведение посева)

     2.2.1. Питательные среды

     Основой данной курсовой работы является  выявление  различных физиологических групп микроорганизмов, путём посева на различные элективные питательные среды.

     Для учёта аммонифицирующих бактерий, используют МПА (мясо-пептонный агар). Он составляется так: к 1литру мясо-пептонного бульона добавляют 15-20 г агара; затем получившуюся среду нагревают до 100^оС (температура плавления агара) и устанавливают слабо щелочную реакцию среды 20%-ным раствором Na₂CO₃ и затем разливают по пробиркам.

     Для учёта бактерий использующих минеральные  формы азота и актиномицетов мы использовали среду Ваксмана. Состав: глюкоза — 10,0; пептон — 5,0; КН₂Р0₄— 1,0; MgS0₄-7H₂0 — 0,5; вода водопроводная — 1000 мл. Среда служит для выявления мицелиальных грибов (Руководство к практическим занятиям по микробиологии М.Н.Пименова, Н.Н. Гречушкина, Л.Г. Азова, А.И. Нетрусов и др. 2004г).

     Для выявления микроскопических грибов – среду Чапека. Состав среды Чапека (г/литр раствора):  Сахароза-30г; NaNO₃-3г; KH₂PO₄-1г; MgSO_4*7H₂О-0.5г; KCl-0.5г; FeSO_4*7H₂O-0.01г; Агар-агар15г. Мы же использовали модифицированную среду Чапека, добавив в неё 2% молочной кислоты.

     Для определения анаэробных бактерий Clostridium использовали жидкую среду Виноградского. Эта среда содержит глюкозу, двузамещенный фосфат калия, сульфат магния, относительно малое количество поваренной соли, сульфатов железа и марганца, а также мел.

     Так же мы использовали среду Эшби для выявления Azotobacter chroococcum по обрастанию комочков почвы.  Среда состоит из К₂HPO₄ – 1;  MgSO_4*7H₂O -0,5;  NaCl –0,5;  FeSO_4*7H₂O – 0,1;  MnSO_4*4H₂O – 0,01. Подготовка почвы проводилась методом приготовления децинормальных разведений с дальнейшим поверхностным посевом на плотные среды и глубинным посевом на среду Виноградского. (Приготовление почвенных суспензий и посев ”Практикум по микробиологии” Е.З. Теппер В.К. Шильникова Г.И. Переверзева 2004г).

      2.2.2 Приготовление почвенной суспензии

       10г почвы помещают в колбу  емкостью 250 мл с 90 мл стерильной  водопроводной воды, интенсивно взбалтывают вращательным движением (не смачивая пробки) 10 мин. Затем методом разведения готовят суспензии, содержащие разное количество почвы: из предыдущего разведения стерильной пипеткой переносят 1 мл суспензии в пробирку, содержащую 9 мл воды. В первой пробирке 1 мл суспензии, приготовленной по этому методу, соответствует разведению 10^-1.

      Из  полученных разведений делают посев  на жидкие и плотные питательные среды.

      Если  численность отдельных групп  микроорганизмов в почве небольшая, их выявляют методом обрастания комочков почвы.

     2.2.3.Определение влажности почвы

     W = (m₁ - m₀)100 / (m₀ - m), где

m - масса пустого бюкса с крышкой, г; m₁ - масса влажной почвы с бюксом и крышкой, г; m₀ - масса высушенной почвы с бюксом и крышкой, г. Далее следуют данные по дерново-подзолистой тяжелосуглинистой почве.

m =23,7; m₁= 54,2;  m₀=49,4 г

W = (54,2 - 49,4)100 / (49,4 - 23,7)  = 18,9 %. 

     Это необходимо знать, вследствие влияния  влажности почвы на деятельность микроорганизмов. Ведь микроорганизмы способны жить и размножаться только в присутствии свободной воды, представленной главным образом в капельножидком виде. Именно оттуда берут питательные вещества для своей жизнедеятельности почвенные микробы. И хотя большинство микроорганизмов, способны хорошо переносить дефицит влаги, нельзя не учитывать действие влаги на микроорганизмы и реакции которые они производят.

     В почве с тяжёлыми металлами W = 32,4%, в огородной W = 20,4% 
 
 
 
 
 

2.2.4. получение результатов, вычисления

     Образец №1 
1) Общее кол-во микроорганизмов в 5 разв. = 36*105/ 0,81 = 4444444 
2) Общее кол-во микроорганизмов домин. в 5 разв. = 36*105/ 0,81 = 2592593 

     Образец №2 
1) Общее кол-во микроорганизмов в 5 разв. = 23*105/ 0,68 = 3382352 
2) Общее кол-во микроорганизмов домин. в 5 разв. = 21*105/ 0,68 =3088235 
 
Образец №3 
1) Общее кол-во микроорганизмов в 6 разв. = 69*106/ 0,8 = 86250000 
2) Общее кол-во микроорганизмов домин. в 6 разв. = 39*106/ 0,8 = 48750000

     Среда Ваксмана 
Образец №1 
1) Общее кол-во микроорганизмов в 6 разв. = 71*106/ 0,81 = 8765432 
2) Общее кол-во микроорганизмов домин. в 6 разв. = 54*106/ 0,81 = 66666667 
3) Общее кол-во актиномицетов в 6 разв. = 5*106/ 0,81 =6172835 
 
Образец №2 
1) Общее кол-во микроорганизмов в 5 разв. = 25*105/ 0,68 =3676470 
2) Общее кол-во микроорганизмов домин. в 5 разв. = 23*105/ 0,68 = 3382352 
3) Общее кол-во актиномицетов в 5 разв. = 30*105/ 0,68 =441176 
 
Образец №3 
1) Общее кол-во микроорганизмов в 5 разв. = 14*105/ 0,8 =1750000 
2) Общее кол-во микроорганизмов домин. в 5 разв. = 6*105/ 0,8 = 750000 
3) Общее кол-во актиномицетов в 5 разв. = 2*105/ 0,8 =250000