Анаэробные азотфиксирующие бактерии рода Clostridium

     Аннотация……………………………………………………………………..3

1. Теоретическая часть

     Введение………………………………………………………………………4

1. Общая характеристика бактерий рода Clostridium………………5
2. Фиксация атмосферного азота бактериями рода Clostridium и факторы, обуславливающие её уровень………………………….
3. Эффективность азотфиксации Clostridium в различных почвах..9
4. Влияние внешних факторов на активность анаэробных азотфиксаторов в почвах…………………………………………………...14

         II..…Практическая часть.

2. Объекты и методы исследования……………………………………..…15

2.1 Объекты…………………………………………………………………..15

          2.2 Методы биологического исследования почвы (подготовка почвы к                    анализу и проведение посева)………………………………………………..……16

         2.2.1. Питательные среды………………………………...………………17

              2.2.2 Приготовление почвенной суспензии……………………………..18

         2.2.3.Определение влажности почвы……………………………...…….18

             2.2.4. получение результатов, вычисления…………………...………….19

3. Результаты опыта……………………………………………...…………22

III. Выводы………………………………………………………………………….23

Список используемой литературы………………………………………………..24 
 
 
 
 
 
 

     Аннотация

     В теоретической части работы рассмотрены  особенности фиксации азота анаэробными  почвенными бактериями рода Clostridium в различных почвах, а так же факторы, влияющие на азотфиксацию.

     В практической части представлены результаты опыта по учету численности микроорганизмов в различных образцах дерново-подзолистых почв. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

2. Теоретическая часть

     Введение

     Среди процессов, от которых зависит биологическая  продуктивность является фиксация микроорганизмами азота. Проблема биологической азотфиксации относится к числу основных проблем  сельскохозяйственной и биологической  науки. Перед учеными стоит задача изыскать возможности управления процессом  азотфиксации и на этой основе увеличить  урожайность сельскохозяйственных культур.

     Азот  является абсолютно необходимым  элементом для всех живых организмов. Основным резервуаром азота служит земная атмосфера. Эукариотические  организмы не способны усваивать  азот непосредственно из атмосферы. Такой способностью обладает ограниченное количество видов прокариот, которых  называют азотфиксаторами, а процесс  связывания азота атмосферы (восстановление до ) этими организмами - биологической азотфиксацией.

     Биологическая азотфиксация представляет собой глобальный процесс, обеспечивающий существование  жизни на Земле. Общая мировая  биологическая фиксация азота составляет 17,2· т/год, что в четыре раза превышает связывание N2 в форме NH3 на предприятиях химической промышленности. 
 
 
 
 
 
 
 
 

2. Общая характеристика бактерий рода Clostridium

     Первый  анаэробный микроорганизм, усваивающий  молекулярный азот, был выделен и  описан С. Н. Виноградским в 1893 г. Он оказался спорообразующей бактерией, которой было дано наименование Clostridium pasteurianum (родовое название происходит от латинского слова clostrum — веретено; видовое — pasteurianum — дано в честь Луи Пастера). (http://dic.academic.ru/dic.nsf/enc_biology/Клостридиум)  

     Клетки  CI. pasteurianum крупные, их длина 2,5—7,5 мкм, ширина 0,7—1,3 мкм. Располагаются они поодиночке, парами или образуют короткие цепочки. Молодые клетки подвижны, имеют перитрихиально расположенные жгутики, плазма их гомогенна. При старении клетки плазма становится гранулированной, в ней накапливается гранулеза (вещество тина крахмала). В центре клетки или ближе к ее концу формируется спора, которая в поперечнике значительно шире, чем вегетативная клетка, и поэтому клетка в этот период приобретает форму веретена. В присутствии кислорода воздуха Cl. pasteurianum может развиваться только при наличии в среде аэробных бактерий, поглощающих кислород; организм малочувствителен к реакции среды и встречается как в кислых, так и в щелочных почвах. (Емцев, Мишустин, 2005) 

1.3Фиксация атмосферного азота бактериями рода Clostridium и факторы, обуславливающие её уровень

     Источником  азотного питания для бактерий рода Clostridium могут служить соли аммония, азотной кислоты и многие содержащие азот органические соединения. При отсутствии указанных соединений бактерии усваивают молекулярный азот. (Емцев, Мишустин, 2005)

     В литературе обычно способность фиксации атмосферного азота отмечают только у Clostridium pasteurianum, хотя эта способность не является свойством лишь этого вида и, возможно, присуща ещё другим видам этого рода, в котором насчитывают сейчас 93 вида.

       Источником углерода для Cl. pasteurianum может быть широкий набор углеродосодержащих соединений – моносахариды, дисахариды, некоторые полисахариды (декстрин, крахмал) и органические кислоты. Развиваясь  на питательных средах, содержащих углеводы, Cl. pasteurianum разлагает их с образованием масляной и уксусной кислот, диоксида углерода и водорода. Освобождающаяся при сбраживании углеводов энергия частично идет на усвоение молекулярного азота атмосферы. (Емцев, 1974)

     Cl. pasteurianum обычно считался слабоактивным фиксатором азота. Пределом его активности было связывание 1-3 мг азота на 1 г сброженного сахара. Однако, используя питательные среду, наиболее отвечающие физическим потребностям Cl. pasteurianum, его активность удалось повысить до 10-12 мг азота на 1 г  сброженного сахара, в некоторых случаях и более. Эффективность фиксации азота анаэробными бактериями рода Clostridium (Cl. pasteurianum, Cl. butyricum) в чистой культуре весьма непостоянна, что обуславливается, по-видимому, разнообразием внешних факторов, способных влиять на течение этого процесса. Так, на величину фиксации азота атмосферы Clostridium влияет источник углерода. В.Л Омелянский (1923) наблюдал, например, что Cl. pasteurianum, экономичнее всего используют декстрозу. (Мишустин, Емцев, 1976)

     Концентрация  углевода также оказывает влияние  на фиксацию азота Clostridium: чем выше концентрация сахара, тем ниже полезный эффект связывания азота на грамм сброженного энергетического материала (Winogradski, 1902; Ternetz, 1904; Bredemann, 1909; Pringsheim, 1909; Омелянский, 1923; Krishna, 1928a, b; Jensen, Spencer, 1947; и др.). Так, в одном из опытов Принсгейма в 0,5%-ном растворе декстрозы на каждый разложенный грамм Cl. americanum фиксировал 3,2 мг азота, в 2%-ном растворе – 2 мг и в 4%-ном  - 1,2 мг. В.Л. Омелянский (1953) также показал, что в среде, содержащей 0,5% сахара на каждый использованный грамм углевода, Cl. pasteurianum фиксировал 4,56 мг азота, в среде с 1%-м содержанием сахара – 3,14 мг, а при 3% углевода – только 1.93 мг азота. (Емцев, 1974)

     В опытах Бредемана (Bredemann, 1909) и других исследователей нередко наблюдалось, что чем ниже процент сброженного сахара, тем выше относительное количество фиксированного азота. По-видимому, причиной этого в концентрированных средах является быстрое падение pH среды, низкие показатели которого отрицательно влияют на жизнедеятельность Clostridium.

     Уровень фиксации азота Clostridium определяется также наличием в среде связанного азота. Как известно, усвоение молекулярного азота происходит в среде, лишенной связанного азота и бедной им. В то же время, как сообщают одни авторы (Winogradski, 1895, 1902; Mc Coy et al., 1928; Willis, 1934), фиксация азота прекращается, если в среде отношение исходного количества связанного азота (аммиачного) к сахару равно 6:1000. Другие исследователи (Омелянский, 1913; Федоров, 1952) указывают на отношение 16:100, третьи (Truffaut, Bezssonoff, 1921) – 62:1000. Возможно, что эти расхождения в действии связанного азота на азотфиксацию Clostridium являются результатом использования в опытах различных сред и разных штаммов анаэробов. (Мишустин, Емцев, 1987)

     В настоящее время все больше исследователей согласны с тем, что для развития азотфиксаторов необходимо некоторое  количество связанного азота для  выработки организмами азотфиксирующих  ферментов (Hino, Wilson, 1958; Proctor, Wilson, 1958, 1959; Федоров, Калинская, 1959ж Львов, 1964; Сахипов, 1969; и др.). (Емцев, 1974)

     Наличие в среде минеральных веществ  также заметно отражается на активности фиксации азота атмосферы Clostridium. Так, добавление мела (CaCO₃) к среде Виноградского положительно влияет на величину азотфиксации (Winogradski, 1895, 1902; Willis, 1934; и др.). Применение углекислого магния отрицательно сказывается на активности фиксации азота. Внесение поваренной соли (NaCl) в одних случаях понижает активность связывания азота атмосферы, в других, наоборот, повышает ее. Это, по-видимому, объясняется особенностями испытуемых штаммов Cl. pasteurianum, определяемыми экологическими условиями их существования. (Емцев, 1976)

     Особый  интерес представляют исследования, посвященные изучению влияния микроэлементов (молибдена, ванадия и др.) на фиксацию азота атмосферы Clostridium. Молибден и ванадий оказывают действие на общий метаболизм Clostridium, их влияние состоит главным образом в ускорении процесса азотфиксации, как у азотобактера.

     Показана  также потребность Clostridium в солях железа при развитии этих организмов на средах, не содержащих связанных форм азота (Федоров, 1952; Carnahan, Castle, 1958; Pulay et al., 1959; Диневич, 1961). (Емцев, 1974)

     Интересно отметить, что бактерии рода Clostridium, находясь в ассоциациях с другими микроорганизмами, всегда обнаруживали более высокую фиксацию, чем в чистых культурах ( Pringsheim, 1910; Delim, 1931; Jensen, 1941; Омелянский, 1953; Емцев, 1960; и др.) Исследования симбиотических взаимоотношений Cl. pasteurianum с естественным спутником Bac. closteroides показали, что эта ассоциация обладает более высокой азотфиксирующей активностью.

     Также отмечено, что на азотфиксацию Clostridium  влияет значение pH среды – кислотность не оказывает существенного влияния на фиксацию азота, но при увеличении щелочности среды наблюдается понижение интенсивности азотфиксации примерно на 2%. (Мишустин, Емцев, 1976)

     Что касается влияния окислительно-восстановительного потенциала на эффективность анаэробной фиксации азота, то, согласно исследованиям  М.В. Федорова (1952), добавление гидрохинона, несколько понижающего окислительный потенциал среды, по крайней мере в первые периоды развития Cl. pasteurianum, не оказало заметного влияния на эффективность усвоения им атмосферного азота. Хинон же, в некоторой степени повышающий окислительный потенциал, в первые периоды культивирования вызвал явное увеличение продуктивности азотфиксации.

     Аналогичные результаты были получены автором и  в опыте с аскорбиновой кислотой. Эффективность фиксации азота Cl. pasteurianum в среде с аскорбиновой кислотой возросла на 10-20%. В опыте с фумаровой кислотой, имеющей окислительный потенциал около +15 мв, положительного эффекта не было. (Емцев, 1976)

     Количественные  данные об эффективности фиксации азота  бактериями рода Clostridium, полученные в последние годы, значительно выше, чем известные раньше. Причину низкой фиксации азота Clostridium следует искать в применявшихся методах культивирования бактерий рода Clostridium, в первую очередь в использовании элективной безазотистой среды.

     Действительно, безазотистая среда Вмноградского  не содержит питательных веществ (витаминов, вминокислот, ростовых веществ и т.д.), необходимых для нормального развитоия микробов. Отсутствием этих соединений объясняется слабая фиксация атмосферного азота бактериями рода Clostridium. Когда упоминавшиеся выше исследователи (Jensen, Spencer, 1947; Rosenblum, Wilson, 1950; Parker, 1954) заменили безазотистую среду оптимальной (с внесением витаминов, аминокислот и т.д.), уровень фиксации азота атмосферы Cl. pasteurianum значительно повысился. (Мишустин, Емцев, 1976) 

1. 4. Эффективность азотфиксации Clostridium в различных почвах.

     Результаты  исследований показали, что почвенно-климатические  условия влияют не только на распространение  бактерий рода Clostridium, но также на определенные физиологические признаки данных микроорганизмов. (Мишустин, Емцев, 1976)

     В литературе имеются указания на различный  уровень азотфиксации Cl. pasteurianum в зависимости от типа почвы, из которой выделена культура. Так, по данным В.Л. Омелянского (1923), штаммы Cl. pasteurianum , выделенные из оподзоленного суглинка, фиксировали 2,38 мг, из черноземной почвы - 1,89 мг, из краснозема – 1,53 мг азота на 1 г сброженного сахара. На различие в азотфиксирующей активности Clostridium, изолированных из различных почвенных типов, указывают также А.В. Рыбалкина (1952, 1957), В.Липшиц (цит. по Френкель, 1956). (Емцев, 1976)