Виды фальсификации

Протягом досить тривалого періоду стан нормативно-методичної бази мікробіологічних досліджень харчових продуктів залишався поза увагою відповідних державних інституцій. Наслідком цього стало суттєве  відставання України в цьому  питанні навіть від найближчих країн-сусідів. Проголошений Україною курс на євроінтеграцію ставить на порядок денний необхідність перегляду національних стандартів та нормативів з метою узгодження з відповідними документами ЄС. Якщо в ділянці нормативного забезпечення методів мікробіологічних досліджень вже почалися позитивні зрушення [1—5], то перелік мікробіологічних показників безпеки та їх нормативи, практично, лишаються незмінними з часів СРСР. За цей же час в Росії здійснено вже друге видання СанПіНу щодо гігієнічних вимог до харчових продуктів [6].  

Інтенсивне впровадження нових технологій виробництва, створення  нових видів харчових продуктів, використання нетрадиційної сировини та вакуумне пакування загалом збільшують ризик харчових отруєнь та мікробіологічного  псування продуктів. Свій внесок вносять і так звані "нові патогени" — такі як Listeria monocytogenes, веротоксигенні E. coli (0157), Enterobacter sakazakii, представники родів Campylobacter, Yersinia та деякі інші мікроорганізми-збудники патології, пов'язаної з харчовими продуктами.  

Інтереси виробників та імпортерів харчової продукції вимагають  скорочення часу на проведення лабораторних досліджень, з яких мікробіологічні  є чи не найтривалішими. Однак новітні  розробки експрес-методів не можуть бути офіційно визнані без відповідної їх валідації та нормативного забезпечення.  

З усього комплексу  питань, які було окреслено вище, найбільш актуальними, на нашу думку, є  такі:

1) перегляд існуючих  мікробіологічних показників безпеки  з особливою увагою на регламентацію  "нових патогенів", а також удосконалення методичних підходів до оцінки відповідності продукції гігієнічним нормативам;

2) створення  організаційно-правових умов для  запровадження нових методів,  які дозволять кардинально підвищити  якість мікробіологічних досліджень  харчових продуктів (валідація методів та розробка методичних документів щодо їх використання).  

До традиційних  збудників мікробної патології  аліментарного походження останнім часом додалися ряд нових, серед  яких найбільше занепокоєння викликають Listeria monocytogenes, Enterobacter sakazakii та веротоксигенні E. coli (VTEC).  

Бактерії роду Listeria досить поширені в оточенні людини та тварин. Із 7 видів, віднесених до цього  роду, епізоотичне та епідеміологічне  значення має переважно 1 вид, а саме L. monocytogenes, який вперше було висіяно в 1940 р. в Швеції від загиблого кроля. Основним резервуаром збудника в довкіллі визнано тварин (більш як 50 видів, але переважно вівці) та неякісні корми. У людей частіше виявляють серотип 4, а у тварин — серотип 1. У дорослих людей лістеріоз проявляться у формі менінгоенцефаліту, рідше — сепсісу. Вважається, що інфекція поширюється гематогенним шляхом з кишківника, який є воротами інфекції. Численні дослідження підтвердили нейротропізм лістерій, а також особливу вразливість до них матки та ембріону. Зростання захворюваності людини на лістеріоз, яке спостерігається з 1980 р., однозначно було пов'язано з аліментарним фактором (табл. 1). Дослідження останніх років показали високий процент інфікованого цим мікроорганізмом м'яса забійних тварин, птиці, продуктів їхньої переробки, а також свіжого молока (табл. 2). Важливо, що L. monocytogenes виявляють в готових до вживання м'ясних продуктах з великим терміном зберігання, в тому числі у вакуумній упаковці, а також молоці і деяких видах м'яких сирів.  

Необхідно відзначити, що навіть висока концентрація патогена не викликає органолептичних змін інфікованої  їжі. Вважається, що персистенція лістерій в зазначених продуктах пов'язана  з їх відносно високою стійкістю  до фізико-хімічних факторів середовища та нетиповою для бактерій здатністю до розмноження в широкому діапазоні температур від 0 до 45 °С. Для захворювання дорослої людини необхідна досить велика інфікуюча доза, характерна для збудників харчових токсикоінфекцій (105–108 клітин в 1 г). Ризик захворювання, в першу чергу, припадає на імунокомпрометованих осіб. Для виявлення L. monocytogenes в харчових продуктах, на відміну від діагностичних досліджень, необхідним є попереднє збагачення в селективному рідкому середовищі (Fraser Listeria Enrichment Broth) протягом 24–48 годин при 30—37 °С. Після цього здійснюють пересів на агарові середовища з наступним підтвердженням за культуральними та біохімічними ознаками. При епідемічних спалахах проводять серологічне типування висіяних штамів. Критерій відсутності L. monocytogenes в 25 г продуктів тваринного походження прийнятий в країнах ЄС та Російській Федерації. Методичне забезпечення виявлення цього збудника в харчових продуктах створено і в Україні [9, 8]. Проте, вирішуючи нагальне питання про регламентацію L. monocytogenes, слід взяти до уваги думку фахівців ЄС про обгрунтованість допустимого вмісту цих мікроорганізмів на рівні <100 клітин в 1 г продукту (виключаючі продукти для дитячого харчування — Настанова наукового комітету з харчових продуктів (SCF) від 22.06.2000 р.). На даний час в нашій країні вже запроваджена вимога щодо відсутності L. monocytogenes в 25 г пташиного м'яса механічного обвалювання [10].  

В 1990–91 рр. у  Великій Британії, Нідерландах, Греції, США та Канаді були зареєстровані спалахи інфекцій серед немовлят, спричинених коліформними бактеріями Enterobacter sakazakii [11]. Перебіг захворювань характеризувався сепсисом, менінгітом та некротизуючим ентероколітом. Летальність сягала 33% [12]. Найбільш вразливими до інфекції були новонароджені (віком до 1 міс.), недоношені, з недостатньою масою тіла, імунокомпрометовані або народжені від ВІЛ-інфікованих матерів [13]. Всього за період 1961–2004 рр. було сповіщено про 50 випадків захворювань дітей, обумовлених E. sakazakii. Останні випадки, що сталися в Новій Зеландії та Франції, охопили 10 дітей, з яких 5 захворіли, а 3 померли. Усі згадані випадки захворювань були пов'язані із вживанням сухих відновлюваних (instant) молочних сумішей, забруднених E. sakazakii. Інфікування відбувалося навіть при незначній контамінації продукту, коли кількість збудника не перевищувала допустимий для коліформних бактерій рівень (1–10 клітин в 1 г). E. sakazakii може потрапляти в сухі молочні суміші в процесі їхнього виготовлення (разом із компонентами, які вносять після сушки, та із довкілля під час пакування) або внаслідок порушення гігієнічних вимог під час відновлення та вживання готового продукту. Перший варіант інфікування реєстрували частіше (50–80%), ніж другий (20–50%). Нерідко E. sakazakii знаходили в загалом "безпечних" зразках дитячого харчування із задовільними показниками щодо загального мікробного забруднення, кількості плісеневих грибів, відсутності колі-форм, E. coli, S. aureus, B. cereus, сальмонел та лістерій [15]. На сьогодні E. sakazakii визнано емержентним патогенним мікроорганізмом, який навіть в невеликих кількостях являє собою загрозу для здоров'я дітей [13]. Директива Комісії ЄС №2073/2005 від 15 листопада 2005 р. [14] містить вимогу про недопущення E. sakazakii в 10 г кожної з 30 паралельних проб сухих молочних сумішей для дитячого, дієтичного та лікувального харчування. Визначення E. sakazakii в харчових продуктах унормовано стандартом ISO/DTS 22964, який доцільно запровадити в Україні.  

Бактерії E. sakazakii належать до коліформних з родини Enterobаcteriacea і раніше були відомі як жовтопігментні варіанти E. cloacаe. E. sakazaki віднесені до окремого виду в 1980 р. на підставі ДНК-гібридизації, біохімічних відмінностей та антибіотикорезистентності. Ці бактерії досить поширені в довкіллі, хоча їхня екологія вивчена недостатньо. E. sakazakii добре ростуть на селективних накопичувальних середовищах для патогенних ентеробактерій [15], проте їх видова ідентифікація і, насамперед, диференціація із спорідненими бактеріями E. cloacae та Pantoea agglomerans пов'язані з певними труднощами.  

Диференціальні  біохімічні ознаки E. sakazakii наведені в  таблиці 3.  

Вважаємо вищенаведене достатньою підставою для запровадження  в Україні вимоги щодо недопущення E. sakazakii в 10 г сухих молочних сумішей для немовлят в разі виявлення там бактерій родини Enterobacteriaceae. Це відповідало б настанові Комітету ЄС з безпеки харчових продуктів (EFSA) від 9.09.2004 р.  

Початок 90-х років  ознаменувався появою ще одного важливого  чинника харчових захворювань — веротоксигенних (ентерогеморагічних) штамів E. coli (VTEC), які K. Holmes назвав "штамами-убивцями" [17]. Ці штами продукують надзвичайно небезпечний шига-подібний ентеротоксин, синтез якого кодується хромосомним eae-геном [18]. Веротоксигенні E. coli мають надзвичайно високу стійкість у зовнішньому середовищі (в т. ч. до кислого рН), мають малу інфікуючу дозу (десятки та сотні клітин в 1 г) та спричиняють харчові токсикоінфекції з тяжким перебігом. Захворювання характеризується геморагічним колітом з кишковою кровотечею та гемолітичним уремічним синдромом, який призводить до ниркової недостатності. Проблема широко обговорювалась спеціалістами [19, 20] і на сьогодні ці штами досить грунтовно вивчені. Вони належать, переважно, до серотипу 0157:Н7, проте відомі випадки виявлення веротоксигенних штамів 026:NM та 0104:H21 [18, 21, 17] і навіть штамів інших таксономічних груп — Citrobacter freundii [22]. Серед веротоксигенних E. coli виявлено 9 фагоруп, що може бути використано для епідеміологічного типування. Ентеропатогенні E. coli доволі часто забруднюють шкіру тушок курей (до 60% проб), і, що важливо, при подальшому зберіганні за температури +4 °С число бактерій збільшується, і вони активно мігрують в м'язову тканину та в середину яєць [23]. Найбільший ризик щодо зараження VTEC мають напівфабрикати з яловичини, непастеризоване молоко та продукти з нього, непастеризовані овочеві і фруктові соки. В країнах ЄС, починаючи з 1998 р., започатковано програму моніторингу E. coli 0157 в продуктах тваринництва (СТ 98–3935). По її завершенню Науковий комітет з ветеринарних заходів стосовно громадського здоров'я (SVPH) видав Настанову від 21.01.2003 р., в якій не вважає за доцільне запровадження мікробіологічного стандарту щодо веротоксигених E. coli 0157, оскільки загальні заходи по запобіганню фекального забруднення всіх ділянок харчового ланцюга ефективно зменшують ризик кишкових інфекцій, включно з VTEC. Однак відстежування веротоксигенних штамів E. coli в найбільш загрожуваних продуктах має бути продовжено. Під час рутинних мікробіологічних досліджень такі штами слід було б виявляти, хоча б за ознакою сорбіт-негативності. В подальшому їх можна передавати до лабораторій санепідслужби для серологічного підтвердження.  

Як зазначалось  вище, узагальненого документа, який містив би гігієнічні вимоги до харчових продуктів, в Україні і досі не розроблено (окремі випадки перегляду показників безпеки мали місце лише під час узгодження нових Державних стандартів на харчові продукти та відомчих інструкцій). Відтак, санітарна служба та випробувальні лабораторії змушені керуватись в своїй роботі "Медико-биологическими требованиями и санитарными нормами качества продовольственного сырья и пищевых продуктов", затвердженими в 1989 р. Попри проблеми, пов'язані з невідповідністю сучасній номенклатурі харчових продуктів, яка значно розширилась за останні десятиліття, цей документ має ще одну суттєву ваду. Закладений в ньому принцип жорсткого детермінізму міцно прив'язує рішення про відповідність (продукта) до одного єдиного числового значення гігієнічного нормативу. Лише для м'яса та яєць передбачені певні межі (105–106 та 5х102–5х103 мікробних клітин в 1 г), тобто задовільний та максимально-допустимий рівень показника загального мікробного забруднення. Наслідком цього є абсурдна ситуація, коли, скажімо, при нормативі 5,0 результат, що дорівнює 4,9, слід вважати відповідним, а результат 5,1 — невідповідним. Не варто нагадувати, що інколи ціна такого рішення може бути критичною, як для державних органів, так і для суб'єктів підприємницької діяльності. Відомо, що світ має ймовірнісну природу. Отож давно вже на часі перехід на варіаційний принцип, коли числові значення показників безпеки та рішення про відповідність нормативам визначають, враховуючи допустимі похибки (невизначеність) результату випробувань та величини ризику, пов'язаного з даним продуктом. Такий підхід вже запроваджено Державною фармакопеєю України для визначення мікробної чистоти лікарських засобів [24]. Чинні стандарти ЕС теж передбачають використання двох числових значень мікробіологічного нормативу (m та M). При цьому "m" вважається оптимально-прийнятним значенням, яке походить із середніх даних відповідних показників на підприємствах з належною культурою виробництва (GMP — good manufacturing practice), а "M" оцінюється як гранично-прийнятне значення, що відповідає гігієнічному нормативу безпеки.  

Відповідними (прийнятними) вважають результати, які не перевищують m, задовільними (гранично-прийнятними) — результати, які знаходяться в діапазоні (>m< M), невідповідними (неприйнятними) — результати, що перевищують M. Залежно від потенційної небезпеки та можливості її посилення/послаблення під час реалізації тих чи інших харчових продуктів розроблено 15 варіантів протоколів мікробіологічних досліджень (sampling plan) [25]. Такий протокол передбачає необхідну кількість паралельно досліджених проб продукції (n) та максимальне допустиме число задовільних (гранично-прийнятних) проб (с). Критерій прийнятності (відповідності гігієнічним вимогам безпеки) даної партії продукції визначається як співвідношення n/c, при умові, що результат жодної проби не перевищує М. Критерій n/c коливається від 50/0 для L. monocytogenes та 30/0 для E. sakazakii в швидкорозчинних продуктах дитячого харчування до 5/2 для ентеробактерій, E. coli та S. aureus в більшості харчових продуктів. Загальне представлення такого мікробіологічного нормативу подано в таблиці 4. Зазначені підходи повною мірою мають бути застосовані для розробки мікробіологічних вимог безпеки харчових продуктів в Україні.  

Виробництво харчових продуктів, насамперед пов'язане з  експортно-імпортними операціями, вимагає  скорочення терміну мікробіологічних досліджень, проведення яких традиційними методами забирає щонайменше 4 доби. Ці методи не відповідають сучасним вимогам до моніторингу технологічного процесу виготовлення харчових продуктів, оскільки не дозволяють оперативно одержувати необхідну інформацію та вживати коригуючих заходів. Експрес-методи мікробіологічних досліджень активно розробляють ще з 70-х років минулого століття, але вони не дозволяли суттєво вплинути на тривалість випробувань, оскільки стосувались лише етапу ідентифікації. Дійсно революційні зміни сталися лише останніми роками, після впровадження в практику методу, що грунтується за зміні електропровідності поживного середовища під час росту мікроорганізмів — так званого імпедансного методу. В поєднанні з досягненнями комп'ютерної техніки це дозволяє захистити процес обчислення результату від несанкціонованого втручання і представити його в друкованому вигляді з дотриманням всіх вимог ДСТУ 17025 щодо простежуваності результатів вимірювань. Приклад відповідного протоколу представлено на малюнку 1. Прототип приладу, працюючого на принципі вимірювання активної провідності, вперше був продемонстрований в 1973 році фахівцями Torry Research Station Aberdeen на 1-му симпозіумі з експрес-методів та автоматизації в мікробіології та імунології. Але широке впровадження в санітарно-мікробіологічну практику та офіційне визнання в США, Франції та Великій Британії відбулося порівняно недавно [26]. Під час росту і розмноження мікроорганізмів, завдяки розщепленню біополімерів (білків, полісахаридів), в поживному середовищі накопичуються іонізовані сполуки, здатні до проведення електричного струму. Їхня кількість і відповідно електричний опір середовища (імпеданс) прямо пов'язані з концентрацією життєздатних клітин мікроорганізмів на момент вимірювання. В методиці імпедансу важливим є поняття терміну детекції (DT — detection time), тобто часу від початку інкубації проби до моменту появи електричного сигналу. Термін детекції однозначно пов'язаний з початковою концентрацією мікроорганізмів в пробі і дозволяє визначати вміст тих чи інших мікроорганізмів в досліджуваному продукті. За даними окремих лабораторій [27], рівень виявляння методом імпедансу таких важливих патогенів як сальмонели становить 95% і є еквівалентним класичному культуральному методу. Методом імпедансу можна протягом 2–48 годин визначати загальне мікробне забруднення, кількість плісеней, дріжджів та колі-форм, виявляти в певному об'ємі продукту наявність колі-форм, сульфітредукуючих клостридій, коагулазопозитивних стафілококів, молочнокислих бактерій та сальмонел, тобто абсолютну більшість мікробіологічних показників безпеки харчових продуктів. На сьогодні найбільш поширеними є імпеданс-аналізатори Bactometer (bioMerieux, Франція), RABIT (Don Whitley Scientific Ltd.) та Malthus (Велика Британія). Для легалізації імпеданс-методу в Україні треба розробити та затвердити методичні вказівки з його використання, як це вже зроблено відносно тест-системи "Нова-Стік".