Гидробиологический контроль сточных вод

     При использовании данных методов используется покровное стекло 24x24 мм. Проводя препарат, зигзагообразно просматривают 2-3 капли, в каждой по 40 полей зрения, увеличение 100х, подсчитывают все встречающиеся организмы.

     Второй  метод

     Определяется  абсолютная численность организмов в единице иловой смеси. Организмы подсчитывают в счетной камере Горяева, берут произвольное количество иловой смеси и заполняют камеру, увеличение 100-200х , просматривают все квадраты по диагонали или камеру целиком, если микроорганизмов немного. Каждую пробу активного ила подсчитывают 3 раза и вычисляют среднее арифметическое.

     Третий  метод

     Определяется  специфическая плотность организмов, выраженная в тыс.экз. на 1 г сухого вещества (при условии подсчета всей капли иловой смеси).

     О.Г. Никитиной был предложен многоступенчатый метод подсчета откалиброванной капли:

     1 этап - на предметное стекло наносится калиброванная капля иловой смеси объемом 0,01 см³, накрывается покровным стеклом 9x9 мм, просматриваются все поля зрения, при увеличении 100х подсчитываются все организмы.

     2 этап - капля наносится на предметное стекло, накрывается покровным стеклом 24x24 мм, при увеличении 70х подсчитываются только те организмы, которые на 1 этапе не встречались.

     3 этап - капля произвольного объема зажимается между 2 предметными стеклами, при увеличении 100х, подсчитываются единичные организмы [10].

     2.2 Оценка численности и биомассы зоопланктона

     При камеральной обработке собранного материала следует пользоваться счетно-весовым методом. При этом в камере Богорова просчитываются все особи каждого вида. Мелкие организмы просчитываются в части пробы, отбираемой особыми штемпель-пипетками (объемом 0,1-5мл). Для этого пробу необходимо довести до определенного объема в зависимости от обилия планктона. Объем просчитываемой части пробы зависит от ее плотности. Достоверные результаты получают, если в каждой просчитываемой порции число особей одного вида насчитывает не менее 50. Минимальное количество порций должно быть не меньше трех. Количество животных в пробе определяют как среднеарифметическое из всех просчетов. Для учета крупных или малочисленных организмов вся проба просчитывается под бинокуляром.

     От  определения числа организмов в пробе переходят к определению численности. Данные по численности должны бать представлены как количество организмов в единице объема или в столбе воды, сечение которого соответствует выбранной единице площади. Как правило, при сравнении численности зоопланктона в различных водоемах используются данные по числу экземпляров в единице объема, при сопоставлении результатов определения численности зоопланктона и фитопланктона, количество рыбы и так далее применяются величины средней численности под квадратным метром поверхности.

     Биомасса  зоопланктона определяется умножением числа организмов каждого вида на их индивидуальную массу.

     Богатое видовое разнообразие организмов активного  ила свидетельствует о высокой  эффективности очистки. Характер реакции  биоценоза активного ила на неблагополучное воздействие проявляется в снижении видового разнообразия [14].

     2.3 Мониторинг бактериопланктона 

     Отбор проб

     Обязательным  условием микробиологических работ  на водоемах является неукоснительное  соблюдение правил стерильного отбора проб. Стерильность отбора необходима при всех работах, связанных с посевами микроорганизмов на питательные среды. С поверхности вода берется стерильной бутылкой, Предварительно она тщательно моется хромовой смесью, чтобы на стенках не было органических веществ и бактериальных клеток. В горлышко бутылки вставляется ватная пробка с марлевой салфеткой. Сверху накладывают салфетку из жесткой бумаги и завязывают ниткой. 

     Посевы  необходимо проводить не позже чем  через 1 час после взятия образцов воды или же через несколько часов, если хранение проб осуществлялось при температуре 3-5^oС При посевах соблюдают необходимые предосторожности во избежание заражения посевного материала: стол и руки протирают спиртом; горлышки стерильных колб, бутылок и пробирок открывают над пламенем горелки и обжигают их; стерильные пипетки вынимают из упаковки также над пламенем и обжигают их кончики; крышки стерильных чашек Петри при посевах поднимают как можно ниже и на возможно короткое время вблизи горящей спиртовки. Для каждого разведения используют отдельную пипетку. Все операции при посевах выполняются по возможности быстро. 

     Стерилизация  посуды и сред

     Питательные среды, используемые при микробиологических работах, стерилизуют в автоклаве  при 120^оС в течение 20 мин. В автоклаве стерилизуют также воду для разведения, резиновые предметы (пробки, трубки), металлические инструменты и при необходимости посуду. Среды стерилизуют в небольших сосудах (склянках или колбах объемом не больше 1 л); сосуды заполняются средой не более чем на ¹/₃. Колбы закрывают ватной пробкой и обвязывают колпачком из плотной бумаги, на котором простым карандашом пишут название среды. Пробирки с приготовленной для разведений водопроводной водой (или физиологическим раствором — 8,5 г NaCl на 1 л дистиллированной воды) помещают по 10-15 штук в металлические банки с ватной прокладкой на дне и обертывают сверху плотной бумаге. Резиновые пробки заворачивают в плотную бумагу. 

     Поместив  приготовленные для стерилизации предметы ни подставку в автоклав, герметически закрывают крышку. Трубку, выводящую нар, оставляют открытой и начинают нагревать котел. Вода через некоторое время закипает, пар вытесняет воздух из котла. Когда весь воздух вытеснится паром, закрывают выходное отверстие. 

     Как только выход пара прекращен, манометр начинает показывать увеличение давления, которое доводят до 1 атм. Затем уменьшают нагревание прибора настолько, чтобы давление оставалось на одном уровне. Это давление сохраняют 20 мин, затем прекращают нагревание, давление постепенно падает. Когда оно дойдет по манометру до нуля, открывают кран, выводящий пар. Как только пар выпущен, отвинчивают крышку. Предметы вынимают через некоторое время после окончания стерилизации, дождавшись подсушивания бумаги и пробок. 

     Стерилизацию  сухим жаром производят в сушильном шкафу при температуре 150-170^оС. Вся посуда перед стерилизацией должна быть тщательно вымыта, высушена и завернута в бумагу. Чашки Петри заворачивают по четыре вместе. Пипетки перед стерилизацией затыкают с широкого конца ватой и заворачивают поодиночке в узкие длинные ленты тонкой папиросной бумаги. Затем партию пипеток по 15-20 штук заворачивают в плотную бумагу и надписывают на бумаге объемы пипеток. Склянки для отбора проб должны быть закрыты ватной пробкой, а сверху колпачком из плотной бумаги, обвязанным шпагатом вокруг горлышка. Пробирки и пенициллиновые склянки закрывают ватными пробками, заворачивают в плотную бумагу и перевязывают шпагатом. Стеклянные и резиновые пробки для склянок и пробирок стерилизуют отдельно, завернутыми в плотную бумагу, причем резиновые пробки необходимо стерилизовать в автоклаве. 

     Приготовленные  для стерилизации предметы помещают в сушильный шкаф и стерилизуют  при 150^оС в течение 2 часов, при 160^оС — 1 час, при 170^оС — 20 мин. После прогревания при одной из этих температур в течение указанного времени сушильный шкаф выключают и дожидаются падения температуры до комнатной, после чего дверцы шкафа открывают и вынимают простерилизованные предметы [10]. 

       Микроскопический учет общего количества бактерий в воде

     Взятую  для анализа пробу пропускают через мембранный фильтр с диаметром  пор 0,3-0,7 мкм в фильтровальной установке, состоящей из толстостенной колбы  Бунзена, металлической воронки  Зейтца и вакуумного насоса, при  помощи которого понижают давление примерно до 0,4 атм.

     Фильтры предварительно кипятят в дистиллированной воде, которую несколько раз меняют. В зависимости от типа водоисточника, степени его загрязнения и  диаметра воронки фильтруют различные объемы воды. 

     На  фильтре карандашом делается отметка  с указанием места отбора пробы, даты и профильтрованного объема воды. Серию фильтров укладывают в чашку Петри и высушивают на воздухе. На крышку чаши капают 1-2 капли 40%-ного формалина. На чашке делают отметку о дате анализа (месяц, год). В таком виде фильтры могут храниться до их окрашивания карболовым эритрозином. 

     Для окрашивания в чашку Петри  помещают кружок фильтровальной бумаги, которую смачивают краской, на нее нижней стороной кладут фильтры и закрывают крышкой. С внутренней стороны крышки чашки также кладется фильтровальная бумага, чтобы на фильтры не капала конденсационная вода. 

     После окончания окрашивания (в течение 14-16 часов) эритрозин с мембранных фильтров отмывают, перекладывая их пинцетом на листе фильтровальной бумаги, смоченной  дистиллированной водой. Фильтры перекладывают до тех пор, пока они не будут давать слабую розовую окраску фильтрованной бумаге. Затем фильтры высушивают на воздухе. После высушивания рабочая площадь фильтра (со взвесью) должна быть розовой, края — слабо розовыми, а бактерии — ярко красными. 

     Для подсчета микроорганизмов, задержанных  на фильтре, на предметное стекло наносится  капля иммерсионного масла, на него накладывают кусочек окрашенного  мембранного фильтра (примерно ¹/₈ фильтра) фильтрующей поверхностью к объективу. Сверху на фильтр наносят еще каплю масла и просматривают под иммерсионным объективом с 90-кратным увеличением и окуляром с 10-кратным увеличением. В окуляр помещается сетка площадью примерно 2500 мкм². 

     Просчитывать  следует 20 полей зрения в разных местах фильтра, чтобы в просчитываемой сетке было не меньше 50 и не больше 150 микроорганизмов. Одновременно следует окрасить (предварительно прокипятив) и просмотреть под микроскопом контрольные фильтры для учета бактериального загрязнения фильтров. Число бактерий на опытных фильтрах должно быть примерно в 10 раз больше, чем на контрольных. Результаты контроля вычитаются из данных опыта [12]. 

     Расчет  содержания бактерий в 1 мл воды (Х) проводится по формуле (буквенные обозначения см. в приложении 10.2): 

     Где:

     К — переводной коэффициент, постоянный для данного микроскопа, фильтрующего аппарата и просчитываемой сетки, равный отношению ^д/_(в?г);

     а — объем профильтрованной пробы, мл;

     в — площадь роля зрения, мкм²;

     г — количество просчитываемых полей  зрения;

     д — количество бактерий в “г”  полях зрения;

     е — количество бактерий на контрольном  фильтре в “г” полях зрения [5]. 

     Учет  сапрофитных бактерий

     Из  каждой пробы воды для посевов  должно быть осуществлено не менее  двух различных разведений (заранее  намеченных): из каждого разведения посевы должны быть произведены не менее чем в две чашки. Разведение подбирают с таким расчетом, чтобы на чашке росло не меньше 20 и не больше 120 колоний бактерий. Из чистых водоемов для посевов можно брать 0,1-1 мл воды. Для посевов из загрязненных участков берется от 0,01 до 0,00001 мл пробы. Например, если в водоеме ожидается несколько тысяч сапрофитных бактерий в 1 мл, необходимо посеять 0,01 мл, для чего использовать I (0,1 мл) или II разведение (1 мл). При количестве сапрофитных бактерий, доходящем до сотен тысяч в 1 мл, следует посеять 0,0001 мл, для чего использовать III (0,1 мл) или IV разведение (1 мл) и т.д. 

     Техника посева заключается в следующем. Проба воды взбалтывается, исследуемая  вода берется стерильной пипеткой в количестве, предназначенном для посева (в случае необходимости посеять меньше 0,1 мл используют посев из разведений по вышеприведенной схеме), и вносится в стерильную чашку Петри с соответствующей надписью. Питательный мясо-пептонный агар (МПА или МПА:10) должен быть заранее расплавлен на водяной бане и охлажден до температуры 40^оС (колба с расплавленным агаром не должна обжигать ладонь руки). Этот агар выливается из колбы в чашку прямо на внесенную воду. Немедленно по выливании агар тщательно смешивается с исследуемой водой путем легкого вращательного движения чашки на поверхности стола. Агар должен быть распределен по дну чашки ровным тонким слоем без пузырьков воздуха и без незалитых пространств. Надо следить, чтобы агар не попал на борт чашки. После застывания агара чашки переворачивают вверх дном и заворачивают в бумагу, на которой пишется дата. Подсчет выросших колоний на чашках с МПА производят через 7 дней, а на чашках с разбавленным агаром (МПА:10) — через 15 дней. Инкубацию чашек проводят при 20^оС Пересчет на 1 мл делают на основании средних данных, полученных при росте на чашках из одной пробы. Чашки с очень большим или очень малым числом выросших колоний (более 120 или меньше 20 на одной чашке) при пересчете не используют.