Использования лигносульфанатов для получения биокомпозиционных материалов

Изобретение относится  к целлюлозно-бумажной промышленности и может найти применение в  машиностроении, например литейном производстве [17].

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

1.3 Лигнолитические грибы и ферменты

 

Способность грибов разрушать лигниновый компонент  древесины известна давно. Наиболее активными деструкторами лигнина  в природе являются грибы белой  гнили, которые образуют гетерогенную группу, состоящую большей частью из базидиомицетов, относящихся к семействам Agaricaceae, Corticaceae, Pleurotaceae, Strophariaceae и нескольких аскомицетов [18]. Так как в качестве лигнинолитиков изучены преимущественно базидиомицеты, то в узком смысле под грибами белой гнили обычно понимают лигнинолитические базидиомицеты. Наиболее подробно изучены Phanerochaete chrysosporium, Coriolus versicolor и Pleurotus ostreatus. [19]

Структура высокомолекулярной полимерной гидрофобной молекулы лигнина  определяет свойства расщепляющей его ферментативной системы. Такая система должна быть внеклеточной негидролитической и неспецифической. Лигнинолитическая система грибов белой гнили является внеклеточной окислительной и неспецифической, и включает лигнин пероксидазу, Mn-пероксидазу и лакказу [19].

Лигнин - глобулярный нестереорегулярный нерастворимый полимер. Его молекулярная масса более 10 000. Состоит из остатков фенилпропана, соединенных несколькими  типами углерод - углеродных и эфирных  связей. Молекулы этого ароматического вещества при образовании лигнина соединяются друг с другом случайным образом с помощью разных химических связей не подающиеся химическому расщеплению. У растений лигнин образует комплекс с гемицеллюлозой, в которой заключены проводящие пучки. Лигнин обусловливает ригидность растений, а также их устойчивость к механическим повреждениям и действию микробов [20].

С развитием биотехнологии базидиомицеты  становятся доступным источником ферментов  различных классов. Способность  базидиомицетов синтезировать внеклеточные ферменты, характеризующиеся высокой активностью и стабильностью, дает возможность использовать их ферментные комплексы для практических целей [21].

В настоящее время  во всем мире ведется интенсивная разработка технологий на основе базидиальных лигнинолитических грибов и их ферментов как для обработки лигниноцеллюлозных материалов, так и для утилизации лигнинсодержащих отходов, накапливающихся в природе в огромных количествах [22].

Дереворазрушающие базидиомицеты  отличаются высоким содержанием  окислительно-восстановительных ферментов, в первую очередь пероксидазы, Мп-пероксидазы, тирозиназы и лакказы [23]. Высшие базидиомицеты по составу лигнолитических ферментов объединяют в следующие группы:

В первую группу вошли  грибы, обладающие лакказой, лигнин- и  марганецпераксидазой активностью Phellinus ріпі, Trametes hirsuta, Bjerkandera adusta, Phanerochaete chrysosporium.

Вторая группа представлена грибами Lentinus edodes, Panus tigrinus, P. chrysosporium, Dichomitus squalens, обладающих Mn-пероксидазной и лакказной активностью.

Третья группа характеризуется  лигнинпероксидазной и лакказной  активностью - грибы Trametes versicolor, Phlebia radiate, Pleurotus ostreatus.

Грибы, составляющие четвертую группу определены как Pleurotus ostreatus, P. eringii, В. adusta и для них характерна лакказа, арилалкогольоксидаза и другие ароматические оксидазы [24].

Разнообразное сочетание  ферментативных комплексов у лигнинразрушающих  грибов связано в первую очередь с экологическими особенностями грибов, трофической специализацией и является следствием длительной эволюции растений и грибов [25]. Представители различных таксономических и экологических групп обладают сходным составом ферментов. Однако уровень активности внеклеточных ферментов имеет существенную штаммовую и видовую вариабельность [26].

Внеклеточные лигнинолитические  ферментные комплексы грибов белой  гнили включают следующие типы окислительно-восстановительных  ферментов: I. гем-содержащие ферменты, П. флавинсодержащие ферменты, III. целлобиозодегидрогеназа, IV. медьсодержащие ферменты [19].

Помимо лигнинразрушающих  ферментов эти грибы образуют также системы гидролаз, гемицеллюлозы  и целлюлозу [27].

I. Гемсодержащие ферменты, среди которых принято особо выделять лигнинпероксидазы (LiP) и марганец-пероксидазы (МnР). Основная функция этих ферментов - прямое, как у LiP или опосредованное медиатором (вератролом у LiP и ионами Мn у МnР) одноэлектронное окисление ароматических субстратов до соответствующих радикалов и двухэлектронное восстановление перекиси водорода до воды [19].

Лигнинпероксидаза (диарилпропаноксигеназа, Н₂0₂-зависимая оксигеназа, лигниназа, КФ 1.11.1.14) - гемсодержащий фермент с молекулярной массой 39-42 кДа, являющийся донором Н₂0₂. Катализирует различные реакции одноэлектронного окисления ароматических соединений (предпочтительно нефенольных) за счет кислорода перекиси водорода, с восстановлением ее до воды. К ним относят:

1. Сб-Св - разрыв пропильной группы лигнина и модельных соединений.

2. Гидроксилирование  бензильных метиленовых групп.

3. Окисление бензиловых  спиртов до соответствующих альдегидов  и кетонов.

4. Окисление фенолов  и расщепление ароматического  кольца в нефенольных модельных  соединениях лигнина [28, 29].

Полученный арильный катион-радикал спонтанно разрушает различные связи в зависимости от структуры и наличия реактанов. Лигнинпероксидаза способна окислять и фенольные соединения. При этом образуются в результате окисления ферментов нефенольных соединений. Выделено около 15 изоформ данного фермента [28]. Лигнинпероксидаза обнаружена лишь у немногих базидиальных грибов: Phanerochaete chrysosporium, Trametes versicolor, Trametes hirsuta, Panus tigrinus, Coriolopsis occidentalis.

Мn-зависимая пероксидаза  отмечена у таких грибов как Trametes versicolor, Phlebia radiate, Dischomitus squalens и др..

П. Флавинсодержащие ферменты, осуществляющие, в основном двухэлектронное восстановление молекулы кислорода до перекиси водорода и одновременно двухэлектронное окисление ОН-группы, соответствующих субстратов, до карбонильных групп. Среди них - глюкозооксидазы, пиранозо-2-оксидазы, метанол-оксидазы, арилалкогольоксидазы [30].

Глюкозооксидаза - флавинсодержащая оксидаза с молекулярной массой 80 кДа, катализирующая окисление глюкозы, восстанавливая при этом кислород до перекиси водорода. Глюкозооксидаза выявлена у грибов Panus tigrinus, P. Chrysosporium [23].

Пираноза-2-оксидаза ароматических  спиртов, катализирует окисление низших первичных и ароматических спиртов  до соответствующих альдегидов и пероксида водорода [30].

Арилалкогольоксидаза (вератрил-алкоголь оксидаза), внеклеточная флавин-оксидаза с молекулярной массой 72,5-78 кДа, катализирует окисление ароматических спиртов до альдегидов, восстанавливая кислород до перекиси водорода. Арилалкогольоксидаза отмечена у грибов, вызывающих белую гниль древесины: Phanerochaete chrysosporium, Trametes versicolor [30].

Метанолоксидаза (МеО), внеклеточный флавин-содержащий фермент с молекулярной массой 75 кДа, катализирует окисление метанола, выделяющийся при деградации лигнина в реакциях деметилирования фенолов, до формальдегида, восстанавливая кислород до перекиси водорода. Выделена и охарактеризована у Phanerochaete chrysosporium, Trametes versicolor, Panus tigrinus [30].

III. Медьсодержащие ферменты. Разделяют на две группы.

III.1 Голубые оксидазы - лакказа и родственные или  им неголубые оксидаза, осуществляющие  четырехэлектронное восстановление  кислорода до воды с параллельным  одно- или двухэлектронным окислением  преимущественно фенольным субстратом до соответсвующих феноксирадикалов или хинонов. [23]

Катехолоксидаза участвует в гидроксилировании монофенолов до дифенолов и окислении дифенолов в ортохиноны. Она широко распространена среди микроорганизмов и имеет названия, соответствующие катализируемому субстрату: монофенолоксидаза, полифенолоксидаза, фенолаза, крезолаза, тирозиназа и т. п. [30].

Лакказы (бензидол: кислород оксидоредуктаза, КФ 1.10.3.2) - голубая  медьсодержащая оксидаза, которая катализирует четырехэлектронное окисление фенолов, ароматических аминов и фенилендиамина, используя кислород как акцептор электронов с восстановлением его до воды. Практически все исследованные лакказы - это мономеры, гликопротеины с углеводной частью от 1 до 15% массы фермента, которая состоит из остатков маннозы и N-ацетилглюкозамина. Окисляют широкий круг субстратов преимущественно фенольной природы с образованием феноксильных радикалов, а также нефенольные соединения в присутствии специфических электронных переносчиков ABTS или HBT (1-гидроксибензотриазол) [28]. Лакказы древоразрушающих грибов имеют более низким Ph-оптимумом окисления фенольных субстратов, совпадающим с оптимум действия большинства грибных целлюлаз. Так, для лакказ Gaeumannomyces graminis var. tritici, древоразрушающего базидиомицета PM1, Coriolus histris он близок к 4,5Ph, для лакказ других трутовиков (C. zonatus, Tramenas sanguinea, Polyporus pinsitus) составляет 4,9 Ph -5Ph [19].

III.2 Медьсодержащие ферменты, осуществляющие двухэлектронное  восстановление кислорода до  перекиси с одновременным двухэлектроным окислением подходящей спиртовой или альдегидной группы (глиоксальоксидаза, галактооксидаза) [23].

Наибольшей оксидазной активность обладают штамма Trametes hirsute D-5 и Gerrena unicolor М-2 [31].

Лигнин под действием  бурых гнилей преимущественно гидроксилируется и деметилируется и в меньшей степени депомилиризуется. Окисление непосредственно идет до углекислоты с изъятием углерода в основном из боковых цепей и метоксильных групп [30].

Предположительно, лигнинразрущающие  ферменты действуют на поверхности гиф, находящихся в контакте с клеточной стенкой. Вместе с тем, разложение наблюдается не только в местах контакта, но и по всей поверхности люмена, если там находятся всего одна-две гифы гриба, и даже в толще вторичной оболочки. Снижение выхода низкомолекулярных продуктов окисления лигнина (ароматических кислот и альдегидов) после обработки древесины лигнинразрушающими грибами объясняет их окислительным и конденсирующим действием. Однако разные грибы в разной степени окисляют и конденсируют остаточный лигнин [19].

Так было показано, что  выявленная на поверхности мицелия  внеклеточная лакказа штамма гриба Pleurotus ostreatus Dl могут участвовать в начальных этапах метаболизма полициклических ароматических углеводородов (в данной работе хризена). Тогда как гибридная Mn-пероксидаза окисляла образующиеся метаболиты (фталевая кислота) [24].

 

1.3.1 Лигнолитические и гидролитические ферменты гриба Panus tigrinus

 

В природных условиях биодеградация  лигнина инициируется и осуществляется посредством окислительных ферментов, выделяемых грибами в окружающую среду. Эти ферменты образуют так называемый лигнолитический комплекс, включающий лакказу, пероксидазы и вспомогательные перекись-генерирующие ферменты. Роль и место этих ферментов в разрушении лигнина неоднозначна и широко дискутируется в литературе. Для ряда грибов ключевым ферментом являются лакказы, для других - лигнин пероксидаза, для третьих - Мп-пероксидаза. Лигнолитические ферменты в последние годы привлекают внимание в связи с возможностью их использования в биомодификации и биоконверсии лигноцеллюлозных отходов, биоочистке сточных вод и почв от лигнинсодержащих загрязнений и токсических веществ. В связи с этим актуальным является поиск продуцентов и получение стабильных лигноли-тических ферментов.

Хотя лигнин является потенциально богатым энергией материалом, он не может служить единственным источником углерода и энергии, его  деградация возможна при наличии  в среде ростового субстрата, такого как целлюлоза или глюкоза. Деградация лигнина является событием вторичного метаболизма и происходит когда в среде культивирования исчерпываются источники углерода, азота или серы. [21] Разложение лигнина - процесс окислительный, стимулирующее действие кислорода на биодеградацию лигнинового полимера характерно для всех грибов белой гнили. Лигнинолитический процесс у этих грибов подвержен влиянию рН, максимум лигнинолитической активности приходится на рН 4,5 [30].

Ферменты лигнолитического комплекса гриба Panus tigrinus играют важную роль в процессах биотрансформации и биодеградации лигнина.

Данный гриб продуцирует комплекс пероксидаз, в том числе Mn-пероксидазу и секреторную пероксидазу растительного типа.

Мn-зависимая пероксидаза - гемсодержащий фермент (КФ 1.11.1.3), участвующий в деполяризации синтетического лигнина [28]. Она окисляет фенольные соединения в присутствии перекиси водорода. Проявляет активность в среде, содержащей Мn, имеет молекулярную массу 46 кДа [8]. Впервые выделена из культуральной жидкости гриба Ph. chrysosporium. Принцип функционирования фермента заключается в окисление Мn²⁺ до Мn³⁺ с использованием пероксида водорода в качестве окислителя. Активность фермента стимулируется простыми органическими кислотами, которые стабилизируют ион Мn³⁺. В результате взаимодействия последнего с кислотами образуется хелат, обладающий окислительными свойствами [28]. Регенерация Мn осуществляется сопряженной реакцией разложения перекиси водорода. При отсутствии в среде Н₂0₂ Мn-зависимая пероксидаза способна продуцировать пероксид водорода.

Рисунок 3 Пять различных состояний активного центра пероксидаз растений (Семенкова И. Г. Фитопатология. Дереворазрушающие грибы, гнили и патологические окраски древесины / И. Г. Семенкова. - М.: ГОУВПОМГУЛ, 2008. – С. 14.)

Впервые из P. tigrinus выделена и охарактеризована секреторная пероксидаза растительного типа. Изучение физико-химических свойств показало, что этот фермент имеет рН- и температурные оптимумы не характерные для грибных пероксидаз. Фермент проявляет оксидазные и пероксидазные свойства в зависимости от условий функционирования. Характер воздействия фермента на лигнин зависит от величины рН и наличия Н₂О₂. Наиболее специфичным субстратом, как и для растительных пероксидаз, для нее был гваякол. При этом предварительные данные показывают, что она марганец-независимая и по свойствам близка к растительным пероксидазам (Рисунок 3). Исследования по воздействию фермента на лигноуглеводный комплекс древесины и другие лигноцеллюлозные субстраты показали, что при оптимальных условиях в присутствии перекиси водорода он способен окислять лигнин. Однако вопрос участия этого фермента в биодеградации лигнина in situ остается дискуссионным.