История открытия ДНК

    1.3 Изучение химического состава и структуры ДНК  

    Если  основная функция ДНК для многих ученых была понятна, то химическое строение и, в особенности, трехмерная структура нуклеиновых кислот представлялась еще недостаточно ясной. С момента открытия Миллером в 1868 г. "нуклеина" прошло немало времени. Основные сведения по химическому составу были изложены А. Косселем, биохимиком, работавшим на рубеже XIX-XX вв. [5]. Он установил, что нуклеиновая кислота состоит из четырех азотистых оснований, сахара и фосфорной кислоты. Азотистые основания были представлены двумя пуриновыми (аденин, гуанин) и двумя пиримидиновыми (цитозин и урацил) соединениями.  
        В 20-х гг. минувшего столетия П. Левеном и У. Джонсом в эту схему были внесены важные уточнения. Ими было обнаружено, что нуклеиновые кислоты имеют две разновидности: РНК и ДНК, различные по химическому строению. РНК, или рибонуклеиновая кислота, содержит пятиуглеродный сахар рибозу, а в ДНК присутствует дезоксирибоза. Наконец, ДНК не содержит урацила, как это полагал А. Коссель, вместо него имеется тимин. Кроме того, установлено, что азотистое основание, сахар и остатки фосфорной кислоты образуют соединение, названное нуклеотидом. В свою очередь, нуклеотиды образуют с помощью фосфодиэфирных связей некое подобие цепочки.  
       В 1924 г. немецкий химик Р. Фельген предложил гистохимический способ окраски ДНК животных, растений и бактерий. Основу методики составлял реактив Шиффа, который окрашивал ДНК в красно-фиолетовый цвет. С помощью реакции Фельгена ученые установили, что ДНК содержится преимущественно в ядре клетки, а РНК - в цитоплазме.  
       До 1950 г. среди генетиков и биохимиков господствовала тетрануклеотидная теория Ф. А. Левина. Согласно этой теории, все нуклеиновые кислоты - это монотонные макромолекулы, представляющие собою единообразное повторение четырех азотистых оснований - тетрануклеотидов. При этом полярные соотношения аденина, гуанина, цитозина и тимина представлялись как приблизительно равные. Ошибочность этой теории заключалась в том, что структуру ДНК понимали как элементарное химическое соединение, придавая ему линейный характер. Наличие вторичных и третичных структур у ДНК не учитывалось. Это привело к тому, что долгое время ученые считали, что ДНК не способна выполнить функцию носителя информации.  
       Эту теорию опроверг Э. Чаргафф. В 1948 г. Эрвин Чаргафф и Хочкисс применили для количественной оценки компонентов нуклеиновой кислоты тогда еще новый метод хроматографии на бумаге. Анализируя, таким образом, различные образцы ДНК от животных, растений и человека, ученые обнаружили, что точного количественного соответствия азотистых оснований ни в одном из случаев не наблюдалось. Напротив, в зависимости от биологического происхождения ДНК, состав молекулы будет различен. Следовательно, обнаружилось, что ДНК отнюдь не монотонная макромолекула. Обобщая данные своих исследований, Э. Чаргафф в 1949 г. сформулировал правило эквивалентности, которое вошло в историю генетики как правило Чаргаффа. Оно гласит: количественные отношения гуанина всегда равны содержанию цитозина, а содержание аденина соответствует содержание тимина. Математически это можно записать так:  
 
А + Г = ц + Т А + Г = Ц + Т  
 
       В 1952 г. на основании работ Э. Чаргаффа и Хочкисса была сформулирована теория, объясняющая, каким образом ДНК содержит в себе генетическую информацию. Основное положение этой теории звучит так: "Генетическая информация определяется специфической последовательностью четырех нуклеотидных оснований в полинуклеотидной цепи.  
       Следует отметить, что установленные опытным путем количественные соотношения азотистых оснований в молекуле ДНК, выраженные в правиле Чаргаффа, не случайны. Отечественные генетики А. С. Спирин и А. Н. Белозерский пришли к выводу, что зависимость содержания гуанин-цитозиновых пар определяется филогенетическими (т. е. сложившимися в процессе эволюции) связями между организациями различной видовой принадлежности.  
       В 1912 г. отец и сын Брегги изобрели метод рентгеновской кристаллографии, основанный на том, что пучок параллельных рентгеновских лучей, падающих на регулярное скопление атомов, образует так называемую дифракционную картину. Дифракционная картина зависит главным образом от атомной массы атомов и их пространственного расположения. В 40-х гг. Астбюри использовал данный метод для определения пространственной структуры ДНК. На основании полученных рентгенограмм автор предположил, что биополимер ДНК представляет собой стопку из уложенных один над другим нуклеотидов. При этом нуклеотиды представлялись им в виде плоских дисков.  
       Астбюри оставил работу по дальнейшему изучению структуры ДНК. Исследования в начале 50-х гг. по структуре ДНК продолжили три группы ученых. Первую группу возглавил известный в то время своими работами по расшифровке вторичной структуры белков Лайнус Полинг. Вторая группа работала под руководством английского биофизика, члена Лондонского королевского общества Мориса Уилкинса, и, наконец, третью группу представляли Джеймс Уотсон и Френсис Крик.  
Первыми представила свою модель в 1952 г. группа Л. Полинга. Однако она не получила всеобщего признания.  
       Сотрудникам Уилкинса удалось получить очень четкие рентгенограммы ДНК, на которых отчетливо было видно, что молекула нуклеиновой кислоты состоит из двух нитей, и, в частности, подтвердилась гипотеза Астбюри о межнуклеотидном расстоянии, равном 0, 34 нм. Ранее Чаргафф не смог полностью объяснить своих правил, основанных на результатах тщательной аналитической работы с различными образцами ДНК. Однако уже в 1953 г. это сделали молодые ученые Джеймс Уотсон и Френсис Крик. Они создали структурную модель молекулы ДНК, которая полностью соответствовала ограничениям в нуклеотидном составе ДНК согласно правилам Чаргаффа.

    История этого открытия, ставшего крупнейшим событием в естествознании XX в., очень  живо и интересно рассказана одним из авторов новой структурной модели молекулы ДНК в книге «Двойная спираль». Молодые и безвестные ученые встретились впервые в 1951 г. в Кембридже (Англия), куда Уотсон был направлен из Чикаго для усовершенствования в научных исследованиях. Крик работал в Кавендишской лаборатории Кембриджского университета и занимался изучением пространственной структуры белковых молекул. В лаборатории в основном применялся метод дифракции рентгеновских лучей на кристаллах белков. Уотсон заинтересовался ДНК еще до приезда в Англию. В США Уотсон занимался проблемами генетики и биологии бактериофагов (вирусов бактерий). После опытов Эвери он был уверен, что наследственность фагов заключена в фаговой ДНК. Так как ДНК к этому времени была обнаружена в хромосомах всех клеток, то можно было предположить, что ДНК составляет вещество генов. Именно поэтому, попав в лабораторию, пользующуюся рентгеновскими методами, Уотсон решил заняться структурой ДНК. Как биолог, он понимал, что при выборе определенной структуры ДНК нужно учитывать существование какого-то простого принципа удвоения молекулы ДНК, заложенного в ее структуре. Ибо важнейшим свойством генов является их способность к удвоению и передаче идентичных наследственных свойств в ряду поколений от предков к потомкам.  

    Интерес Уотсона к структуре ДНК разделил Крик, который также понимал огромную важность расшифровки наследственного материала. Значительное влияние на работу ученых оказал метод построения молекулярных моделей веществ с учетом всех валентных углов, межатомных расстояний и отбором наиболее  вероятных конфигураций атомных группировок. В 1952 году Лайнусу Полингу, используя этот метод, удалось расшифровать пространственную структуру полипептидной цепи, предложив для нее спиральную конформацию    (α –спираль Полинга-Кори). Криком была создана теория дифракции рентгеновских лучей на спиралях, позволяющая определить, находится исследуемая структура в спиральной конформации или нет. В то время рентгенограммы ДНК уже существовали. Их получили в Лондоне Морис Уилкинс и Розалинд Фрэнклин. При этом оказалось, что ДНК может давать два типа структур в зависимости от содержания воды в препарате. При значительной гидратации ДНК находится в так называемой В-форме, которая переходит в кристаллическую А-форму при потере воды.

    По  характеру рентгенограммы В-формы ДНК Уотсон и Крик поняли, что исследуемая структура находится в спиральной конформации. Они знали также, что молекула ДНК представляет собой длинную линейную полимерную цепь, состоящую из мономеров-нуклеотидов. Фосфодезоксирибозный костяк этого полимера непрерывен, а сбоку к дезоксирибозным остаткам присоединены азотистые основания. Для построения моделей оставалось решить вопрос, сколько цепей линейного полимера уложено в компактную структуру.

    На  основании рентгенограммы В-формы  ДНК Уотсон и Крик предположили, что молекула ДНК состоит из двух линейных полинуклеотидных цепей с фосфодезоксирибозным остовом снаружи молекулы и азотистыми основаниями внутри ее. На рентгенограмме меридиональный рефлекс, соответствующий       3,4 нм, был гораздо интенсивнее остальных. Это могло означать, что пуриновые и пиримидиновые основания толщиной 3,4 нм уложены плоскостями друг на друга перпендикулярно оси спирали. Кроме того, все данные рентгеноструктурного метода и электронной микроскопии говорили о том, что диаметр спирали равен примерно 20 нм. Оставалось также решить вопрос о порядке расположения азотистых оснований двух цепей внутри биспирали.

    Уотсон  предположил сначала, что пары азотистых  оснований (по одному от каждой цепи) образуются по принципу «подобное взаимодействует с подобным». Он считал, что в двух линейных цепях молекулы ДНК аденин расположен на уровне аденина, гуанин – на уровне гуанина и т. д. Таким образом, две линейные полинуклеотидные цепи в молекуле ДНК совершенно идентичны и по составу азотистых оснований и по их последовательности. Была сделана попытка построить модель структуры ДНК, исходя из этого предположения. Однако пурины меньше пиримидинов, и на модели биспирали наблюдались то вспучивания, то сжатия.

    Рассматривая  другие возможные комбинации пар азотистых оснований, Уотсон обнаружил, что пары аденин–тимин и гуанин–цитозин имеют одинаковый размер и стабилизируются водородными связями.

    Сразу же объяснялись и правила Чаргаффа: если в биспирали ДНК аденин одной  цепи всегда соединяется с тимином другой цепи, а гуанин всегда входит в паре с цитозином, то аденина в составе ДНК должно быть всегда столько же, сколько тимина, а гуанина – столько же, сколько цитозина. Ясно было также, как должно происходить удвоение молекулы ДНК. Каждая цепь комплементарна другой, и в процессе репликации ДНК цепи биспирали должны разойтись и на каждой полинуклеотидной цепи должна достроиться комплементарная к ней цепь. 

    Оставалось  лишь построить точную модель подобной структуры с учетом всех требований рентгенографии и законов стереохимии, что ученые и сделали. Они построили остроумную модель и убедились, что все межатомные расстояния и валентные углы подошли. Таким образом, не оставалось сомнения в том, что, созданная ими структурная модель ДНК соответствует законам стереохимии. Рентгеноструктурные данные подтверждали наличие такой структуры. Чрезвычайно заманчивые перспективы открывались и в объяснении биологических явлений. Так,  репликацию ДНК можно было представить в свете новой модели как расхождение цепей родительской ДНК и надстройку на них комплементарных цепей. Результатом явились две новые идентичные молекулы ДНК, в каждой из которых одна цепь была родительской, а другая – вновь синтезированной (так называемый полуконсервативный способ репликации).

    Модель  Уотсона–Крика (рис. 1) получила широкое  распространение и в настоящее  время подтверждена экспериментом. Итак, в соответствии с этой моделью  молекула нативной ДНК состоит из двух линейных полинуклеотидных цепей, спирально закрученных вокруг общей оси и соединенных друг с другом       межнуклеотидными водородными связями. Обе цепочки образуют правозакрученные спирали, но эти спирали являются антипараллельными по отношению к оси биспирали, т. е. порядок расположения атомов в их фосфатно-углеводных составах имеет противоположное направление. Пентозофосфатные составы каждой спирали находятся с внешней стороны молекулы, а пуриновые и пиримидиновые основания расположены в виде стопки внутри молекулы и связаны друг с другом водородными связями. При этом в молекуле ДНК возможно существование только двух комплементарных пар. Плоскости пар азотистых оснований перпендикулярны к оси биспирали.[6] 
 

    Рис. 1 
 
 

       Первичная структура ДНК состоит из нуклеотидных цепей, у которых скелетную основу составляют чередующиеся сахарные и фосфатные группы, соединенные ковалентными связями, а боковые части представлены одним из четырех оснований и присоединяются одна к другой молекулой сахара. Нуклеотиды расположены друг за другом и связаны ковалентно с фосфатом и сахарным остатком, образуя полинуклеотидную цепь.

    Вторичная структура была сформулирована Д.Уотсоном и Ф. Криком. Две идущие рядом нити, скрепленные одна с другой перемычками и свившиеся в двойную спираль, и есть молекула ДНК. Обе нити одинаковы по длине, остатки пар А—Т и Г —Ц разделены одинаковыми расстояниями. Двойная спираль имеет упорядоченный характер, так как каждая связь основание — сахар находится на одинаковом расстоянии от оси спирали и повернута на 36°, причем в каждой из них в зависимости от вида ДНК могут быть до миллионов блоков — нуклеотидов. Порядок их чередования определяет наследственную информацию, записанную в ДНК и передаваемую следующим поколениям. Первое предположение о роли нуклеиновых кислот в качестве генетического материала сформулировал доцент Петербургского университета А. Щепотьев (1914). Химики понимали, что ДНК собрана из нуклеотидов, имеющих фосфатную группу, связанную ковалентно с пятиуглеродным сахаром, который связан с одним из четырех азотистых оснований. Нуклеотиды соединены друг с другом так, чтобы фосфатная группа одного была связана с сахаром предыдущего, и из их чередующихся комбинаций образуется длинная цепочка — сахарофосфатный остов молекулы. По одну сторону под прямым углом к остову располагаются основания.

    Молекула  ДНК оказалась закручена в  спираль: снаружи спирали — остов, а внутри — перпендикулярные ему  основания. На один виток спирали  приходилось примерно по десять нуклеотидов, а ее толщина указывала, что скручено более одной нити. Итак, вторичная  структура отражает форму нуклеиновой кислоты. Степень скручивания ДНК зависит от ферментов.  

    Р.Франклин исследовала на фотопленке пятна  от рентгеновского излучения, рассеянного  кристаллами очищенной ДНК (1952). В  обсуждении результатов принимал активное участие и физик М.Уилкинс, работавший в той же лаборатории. Полученные рентгенограммы стимулировали многих ученых к поиску модели структуры ДНК. История открытия структуры ДНК описана американским биохимиком Дж. Уотсоном в его книге «Двойная спираль» (1968). В 1951 г. Уотсон встретился в Копенгагене с Уилкинсом и ознакомился с рентгенограммами ДНК.

    Уотсон  и Крик, разобравшись в структуре  пуринов (А, Г) и пиримидинов (Т, Ц), решили, что они должны быть связаны между  собой. Для объяснения правила Чаргаффа ДНК должна состоять из двух цепей, которые должны закручиваться так, чтобы сохранялись определенные углы между разными группами атомов. И возникла двойная спираль, в которой пурины и пиримидины выстроены по типу ступенек лестницы: «перекладины» — основания, «веревки» — сахарофосфатные остовы.

    Каждая  перекладина образована из двух оснований: А и Τ или Г и Ц, что  и объясняет правило Чаргаффа. Так как в каждой паре есть одно основание с одним кольцом  и одно — с двумя, величина перекладин одинаковая, и остовы цепей находятся на одном расстоянии. Основания присоединены к двум противоположным цепям, удерживаемым водородными связями между основаниями. Поскольку звеньями цепи являются пары Ц с Г и А с Т, удобнее использовать образ лестницы, составленной из ступенек-пар ЦГ, ГЦ, ТА и AT, следующих в определенном порядке. Из-за закрученности в спираль молекула похожа на винтовую лестницу со ступеньками из пар нуклеотидов.

    В живых клетках цепи очень длинные, содержат до 108 пар в ряд и свиты  в плотный клубок. У человека длина  такой винтовой лестницы в размотанном состоянии достигает нескольких метров, и это одна молекула. Отсюда — огромность числа возможных вариантов расположения молекул в ДНК. И это разнообразие связано с разнообразием жизни, а расположение четырех типов пар в молекуле ДНК задает всю программу, говорит клетке, как ей развиваться и что делать.

    Диаметр двойной спирали 2· 10^-9 м (2 нм), расстояние между соседними парами оснований спирали 0,34 · 10^-9 м (0,34 нм), полный оборот спирали завершается через 10 пар, а длина зависит от организма, которому принадлежит эта молекула ДНК. Длина плодовой мушки (дрозофилы) 4· 10^-3 м, а самой длинной ее хромосомы — в 10 раз больше. У простейших вирусов ДНК содержит несколько тысяч звеньев, у бактерий — несколько миллионов, а у высших — миллиарды. Если выстроить в одну линию молекулы ДНК, заключенные в одной клетке человека, то получится длина в 2 м, т. е. длина в миллиард раз больше толщины. Но она умещается в клеточном ядре, значит, ее «укладка» такова, чтобы по всей длине она была доступна для белков, которым нужно «читать» гены. Основания, соединенные слабой водородной связью, взаимно дополняют друг друга, и каждая цепь автоматически поставляет информацию для нахождения партнера. В эукариотических клетках основные части ДНК и белков сплетены так, что напоминают нить бус. Каждая такая «бусинка» окружена четырьмя ядерными блоками и содержит около 200 сдвоенных оснований, а «нить» состоит из ДНК и ядерного белка (гистона), отличного от того, что входил в состав «бусинок».