Световая микроскопия

     Световая  микроскопия 

     В повседневной практике бактериологической лаборатории микроскопическое исследование, как правило, используют для ускоренной ориентировочной диагностики.

     Основные  задачи микроскопии: выявление возбудителя в клиническом материале, ориентировочная идентификация на основе определения характерных морфологических и тинкториальных признаков микроорганизмов, а также изучение окрашенных мазков из колоний чистых культур. При некоторых инфекционных болезнях, для возбудителей которых характерна специфичность морфологии (про-тозойные болезни, гельминтозы, грибковые заболевания, спирохетозы), микроскопическое исследование — основной или один из основных методов диагностики.

     Материалом  для микроскопического  исследования могут служить кровь, костный мозг, СМЖ, пунктаты лимфатических узлов, фекалии, дуоденальное содержимое и жёлчь, моча, мокрота, отделяемое мочеполовых путей, биоптаты тканей, мазки со слизистых оболочек (ротовой полости, нёбных миндалин, носа, влагалища и др.).

     Для обнаружения кровяных паразитов, например простейших (малярийные плазмодии, трипаносомы, лейшмании, бабезии) и гельминтов (микрофилярии), исследуют препараты крови «тонкий мазок» и/или «толстая капля». 

     Световые  микроскопы предназначены для изучения микроорганизмов, которые имеют размеры не менее 0,2 мкм (бактерии, простейшие и т. п.), a электронные для изучения более мелких микроорганизмов (вирусы) и мельчайших структур бактерий.

     Световые  микроскопы подразделяются на студенческие, рабочие, лабораторные и исследовательские, различающиеся по конструкции и комплектации оптикой. Отечественные микроскопы (Биолам", "Бимам", "Микмед") имеют обозначения, указывающие, к какой группе они относятся (С - студенческие, Р - рабочие, Л - лабораторные, И - исследовательские), комплектация обозначается цифрой.

     В микроскопе различают механическую и оптическую части.

     К механической части относятся: штатив (состоящий из основания и тубусодержателя) и укрепленные на нем тубус с револьвером для крепления и смены объективов, предметный столик для препарата, приспособления для крепления конденсора и светофильтров, а также встроенные в штатив механизмы для грубого (макромеханизм, макровинт) и тонкого (микромеханизм, микровинт) перемещения предметного столика или тубусодержателя.

     Оптическая  часть микроскопа представлена объективами, окулярами и осветительной системой, которая в свою очередь состоит из расположенных под предметным столиком конденсора Аббе, зеркала, имеющего плоскую и вогнутую сторону, а также отдельного или встроенного осветителя. Объективы ввинчиваются в револьвер, а соответствующий окуляр, через который наблюдают изображение, устанавливают с противоположной стороны тубуса. Различают монокулярный (имеющий один окуляр) и бинокулярный (имеющий два одинаковых окуляра) тубусы.

     Основную  роль в получении изображения  играет объектив. Он строит увеличенное, действительное и перевернутое изображение объекта. Затем это изображение дополнительно увеличивается при рассматривании его через окуляр, который аналогично обычной лупе дает увеличенное мнимое изображение.  
 
 
 
 
 

     

     Принципиальная  схема микроскопа и осветительной системы

     1. Источник света;

     2. Коллектор;

     3. Ирисовая полевая диафрагма;

     4. Зеркало;

     5. Ирисовая аппертурная диафрагма;

     6. Конденсор;

     7. Препарат;

     7'. Увеличенное действительное промежуточное  изображение препарата, образуемое  объективом;

     7''. Увеличенное мнимое окончательное  изображение препарата, наблюдаемое в окуляре;

     8. Объектив;

     9. выходной значок объектива;

     10. Полевая диафрагма окуляра;

     11. Окуляр;

     12. Глаз. 
 
 
 
 
 
 

     Увеличение микроскопа ориентировочно можно определить, умножая увеличение объектива на увеличение окуляра.

     Однако  увеличение не определяет качества изображения. Качество изображения, его четкость, определяется разрешающей способностью микроскопа, т. е. возможностью различать раздельно две близко расположенные точки.

     Предел разрешения — минимальное расстояние, на котором эти точки еще видны раздельно,— зависит от длины волны света, которым освещается объект, и числовой апертуры объектива.

     Числовая  апертура, в свою очередь, зависит  от угловой апертуры объектива и  показателя преломления среды, находящейся между фронтальной линзой объектива и препаратом. Угловая апертура—это максимальный угол, под которым могут попадать в объектив лучи, прошедшие через объект. Чем больше апертура и чем ближе показатель преломления среды, находящейся между объективом и препаратом, к показателю преломления стекла, тем выше разрешающая способность объектива. Если считать апертуру конденсора равной апертуре объектива, то формула разрешающей способности имеет следующий вид:

     R= λ/2 NA

     где R - предел разрешения; λ - длина волны; NA - числовая апертура.

     Различают полезное и бесполезное увеличение. Полезное увеличение обычно равно числовой апертуре объектива, увеличенной в 500—1000 раз. Более высокое окулярное увеличение не выявляет новых деталей и является бесполезным.

     В зависимости от среды, которая находится  между объективом и препаратом, различают «сухие» объективы малого и среднего увеличения (до 40 х) и иммерсионные с максимальной апертурой и увеличением (90—100 х). «Сухой» объектив - это такой объектив, между фронтальной линзой которого и препаратом, находится воздух.

       

     Особенностью  иммерсионных объективов является то, что между фронтальной линзой такого объектива и препаратом помещают иммерсионную жидкость, имеющую показатель преломления такой же, как стекло (или близкий к нему), что обеспечивает увеличение числовой апертуры и разрешающей способности объектива. В качестве иммерсионной жидкости для объективов водной иммерсии используют дистиллированную воду, а для объективов масляной иммерсии – кедровое масло или специальное синтетическое иммерсионное масло.

     Использование синтетического иммерсионного масла  предпочтительнее, поскольку его параметры более точно нормируются, и оно в отличие от кедрового, не засыхает на поверхности фронтальной линзы объектива. Для объективов, работающих в ультрафиолетовой области спектра, в качестве иммерсионной жидкости используют глицерин. Ни в коем случае нельзя пользоваться суррогатами иммерсионного масла и, в частности, вазелиновым маслом.

     **Изображение,  полученное с помощью линз, обладает  различными недостатками: сферической  и хроматической аберрациями, кривизной поля изображения и др. В объективах, состоящих из нескольких линз, эти недостатки в той или иной мере исправлены. В зависимости от степени исправления этих недостатков различают объективы ахроматы и более сложные апохроматы. Соответственно объективы, в которых исправлена кривизна поля изображения, называются планахроматами и планапохроматами. Использование этих объективов позволяет получить резкое изображение по всему полю, тогда как изображение, полученное с помощью обычных объективов, не имеет одинаковой резкости в центре и на краях поля зрения. Все характеристики объектива обычно выгравированы на его оправе: собственное увеличение, апертура, тип объектива (АПО - апохромат и т. п.); объективы водной иммерсии имеют обозначение ВИ и белое кольцо вокруг оправы в нижней ее части, объективы масляной иммерсии—обозначение МИ и черное кольцо.

     Все объективы рассчитаны для работы с покровным стеклом толщиной 0,17мм.

     Толщина покровного стекла особенно влияет на качество изображения при работе с сильными сухими системами (40 х).

     При работе с иммерсионными объективами  нельзя пользоваться покровными стеклами толще 0,17 мм потому, что толщина покровного стекла может оказаться больше, чем рабочее расстояние объектива, и в этом случае, при попытке сфокусировать объектив на препарат, может быть повреждена фронтальная линза объектива.

     Окуляры состоят из двух линз и тоже бывают нескольких типов, каждый из которых  применяется с определенным типом  объектива, дополнительно устраняя недостатки изображения. Тип окуляра  и его увеличение обозначены на его оправе.

     Конденсор предназначен для того, чтобы сфокусировать  на препарате свет от осветителя, направляемый зеркалом микроскопа или осветителя (в случае использования накладного или встроенного осветителя). Одной из деталей конденсора является апертурная диафрагма, которая имеет важное значения для правильного освещения препарата.

     Осветитель  состоит из низковольтной лампы  накаливания с толстой нитью, трансформатора, коллекторной линзы и полевой диафрагмы, от раскрытия, которой зависит диаметр освещенного поля на препарате.

     Зеркало направляет свет от осветителя в конденсор. Для того чтобы сохранить параллельность лучей, идущих от осветителя в конденсор, необходимо использовать только плоскую  сторону зеркала

     Настройка освещения и фокусировка  микроскопа

     Качество  изображения в значительной мере зависит также от правильного  освещения. Существует несколько различных  способов освещения препарата при  микроскопии. Наиболее распространенным является способ установки света по Келеру, который заключается в следующем:

     1) устанавливают осветитель против  зеркала микроскопа;

     2) включают лампу осветителя и  направляют свет на плоское  (!) зеркало микроскопа;

     3)помещают  препарат на предметный столик  микроскопа;

     4) закрывают зеркало микроскопа  листком белой бумаги и фокусируют  на нем изображение нити лампы,  передвигая патрон лампы в  осветителе;

     5) убирают лист бумаги с зеркала; 

     6) закрывают апертурную диафрагму  конденсора. Перемещая зеркало и  слегка передвигая патрон лампы,  фокусируют изображение нити  на апертурной диафрагме. Расстояние  осветителя от микроскопа должно  быть таким, чтобы изображение  нити лампы было равно диаметру  апертурной диафрагмы конденсора (наблюдать апертурную диафрагму можно с помощью плоского зеркала, помещенного с правой стороны основания микроскопа).

     7)открывают  апертурную диафрагму конденсора, уменьшают отверстие полевой  диафрагмы осветителя и значительно уменьшают накал лампы;

     8) при малом увеличении (10х), глядя  в окуляр, получают резкое изображение  препарата; 

     9)слегка  поворачивая зеркало, переводят  изображение полевой диафрагмы,  которое имеет вид светлого пятна, в центр поля зрения. Опуская и поднимая конденсор, добиваются получения резкого изображения краев полевой диафрагмы в плоскости препарата (вокруг них может быть видна цветная каемка);

     10) раскрывают полевую диафрагму  осветителя до краев поля зрения, увеличивают накал нити лампы и слегка (на 1/3) уменьшают раскрытие апертурной диафрагмы конденсора;

     11)при  смене объектива необходимо проверить  настройку света. 

     После окончания настройки света по Келеру нельзя изменять положение конденсора раскрытие полевой и апертурной диафрагмы. Освещенность препарата  можно регулировать только нейтральными светофильтрами или изменением накала лампы с помощью реостата. Излишнее открытие апертурной диафрагмы конденсора может привести к значительному снижению контраста изображения, а недостаточное - к значительному ухудшению качества изображения (появлению диффракционных колец). Для проверки правильности раскрытия апертурной диафрагмы необходимо удалить окуляр и, глядя в тубус, открыть ее таким образом, чтобы она закрывала светящееся поле на одну треть. Для правильного освещения препарата при работе с объективами малого увеличения (до 10х) необходимо отвинтить и снять верхнюю линзу конденсора.

     Внимание! При работе с объективами, дающими  большое увеличение - с сильными сухими (40х) и иммерсионными (90х) системами, чтобы не повредить фронтальную линзу, при фокусировке пользуются следующим приемом: наблюдая сбоку, опускают объектив макровинтом почти до соприкосновения с препаратом, затем, глядя в окуляр, макровинтом очень медленно поднимают объектив до появления изображения и с помощью микровинта производят окончательную фокусировку микроскопа.