Основные принципы лечения наследственной болезни генной терапии

ОТРИЦАТЕЛЬНЫЕ СВОЙСТВА:

• Упаковка происходит с низкой эффективностью,
• Репликационно-дефектные мутанты цитотоксичны,
• С вирусным геномом трудно создавать векторные конструкции,
• Сложная регуляция.

Невирусные  подходы к доставке генов развивают многие лаборатории. Привлекает в них несколько вещей. Во-первых - это не вирусы, и, значит, опасности, о которых мы говорилось в разделе о вирусных векторах, пациентам не грозят. Это простые системы и в них можно помещать сколь угодно большие ДНК. Естественно, тут же возникают проблемы доставки. Куда-то надо ее, эту невирусную систему, вводить пациенту, и при этом, чтобы она попала в то место, в те клетки, где она нужна. Допустим, как она будет вести себя в крови? Что с ней будет вытворять иммунная система? ДНК должна быть упакована в таком виде, чтобы она связывалась с клетками мишенями и желательно не связывалась с другими клетками.

Успешная доставка длинной нестабильной полианионной молекулы ДНК в клетку-мишень через три липидных бислоя , т.е. клеточную мембрану и двойную ядерную мембрану требует специальных ухищрений.

Во-первых, надо создать условия, при  которых ДНК не подвергалась бы деградации, механической и энзиматической.

Во-вторых, сделать так, чтобы эта  ДНК выживала перед тем, как она доберется до клеточного ядра, Это значит, что когда ДНК попадает в клетку, она должна избежать эндосом и лизосом и найти путь к ядру.

И конечно, нужно обеспечить долговременную экспрессию генов, содержащихся в ДНК. В основном для этих целей используют две главные стратегии.

В первой из них образуют катионные  липидсвязанные комплексы с ДНК  в составе липосом . Эти комплексы положительно заряжены. Они связываются с клетками мишенями. Они содержат липиды со свойствами сплавляться с клеточными мембранами и облегчать проникновение ДНК в клетки. В частицах не содержится информации, направляющей их прямиком в ядро. Поэтому большая часть генного иатериала, проникшего в клетку оказывается связанной с цитоплазматическими органеллами и уничтожается. Только небольшая часть избегает этой участи.

Во второй стратегии используют имитацию вирусов. В этом случае ДНК  вводят в комплекс с поликатионом (например, полилизином), лигандом для  связывания с клеткой и эндоцитоза (таким лигандом может быть, например, трансферрин или антитело, специфичное к какому-либо поверхностному белку клетки) и специальным агентом, облегчающим высвобождение ДНК из этого комплекса и эндосом в цитоплазме. Такие агенты называют эндосомолитическим . Ими могут служить репликационно-дефектные аденовирусные частицы, влючаемые в комплекс. Для увеличения безопасности таких систем пытаются использовать аденовирусы животных, не способные реплицироваься в человеческих клетках. Лиганд, введенный в комплекс, определяет клеточную специфичность доставки ДНК.

При явных достоинствах, системы  невирусной доставки имеют и серьезные  недостатки. Они малоэффективны. Требуется  очень высокая концентрация частиц, чтобы перенос гена осуществился. Пока неясно, как обстоит дело с проблемами безопасности при их использовании. Пока эти системы испытывались на людях только в стратегии in vivo. Многие склонны считать, что идеальным для целей генной терапии соматических клеток был бы вектор, имитирующий хромосому человека. Такие векторы могли бы быть созданы по образу и подобию природных хромосом, также как созданы дрожжевые искусственные хромосомы - YAC. Для этого они должны содержать три функциональных элемента: Участок, обеспечивающий репликацию (origin of replication) Последовавтельность, обеспечивающую митотическую стабильность - центромеру. Последовательность, обеспечивающую правильную репликацию и устойчивость к нуклеазам - теломеры. Полагают, что такие искусственные хромосомы для клеток млекопитающих появятся в ближайшее время [ Обозрение 1995 ].

Антисенс-олигонуклеотиды еще один подход к генной терапии [ Agrawal ea 1996 ].

В 1978 году было показано, что 13 звенный  олигонуклеотид, комплементарный мРНК вируса саркомы Рауса, может ингибировать репликацию вируса. Это было начало нового подхода, направленного на модификацию  экспрессии гена.

Олигонуклеотид, комплементарный  к определенной мРНК проникает в  клетку и связывается с этой мРНК. Только с нею, и ни с какой другой. В результате трансляция этой мРНК ингибируется специфически. Это может  быть вирусная мРНК, и тогда репликация вируса будет ингибирована. Это может быть мРНК онкогена, экспрессия которого приводит к опухоли и т.д. Идеологически подход похож на стратегию, используемую, когда экспрессию гена подавляют с помощью антисенс РНК. Но есть и существенная разница. Антисенс РНК в генно-терапевтическом смысле постоянно экспрессируется клеткой, в которую для этого вводится специальная генетическая конструкция. Ген этой антисмысловой РНК после введения в клетку становится частью ее генома и поэтому подавляет синтез смысловой РНК изнутри. Антисмысловой же олигонуклеотид приходит в клетку из вне. Его постоянно нужно добавлять, чтобы сделать его действие эффективным. Однако, поскольку действие олигонулеотида также направлено на продукт экспрессии гена внутри клетки, этот подход можно рассматривать, как генно- терапевтический.

В принципе подход очень прост и  привлекателен. Он не требует сложных  конструкций для своего осуществления. Можно надеяться на высокую специфичность  благодаря тому, что можно синтезировать  олигонуклеотиды с последовательностями, встречающимися всего один раз во всем геноме и, следовательно, абсолютно специфически взаимодействующие с мРНК заданного гена.

Однако подход сталкивается со многими  проблемами. Так часто бывает: казалось бы, вот он, простой и симпатичный  метод, а начинаешь его разрабатывать и видишь: и тут не так, как думалось, и там не этак. Оказалось, что олигонуклеотиды природной структуры недостаточно стабильны, когда вводятся в организм, возникают проблемы с проницаемостью клеток для олигонуклеотидов, возникают проблемы со специфичностью связывания с нужной мишенью, поскольку олигонулеотиды могут свзываться не только со строго комплементарными последовательностями, но и с частично комплементарными и т.д.

Тем не менее,и это тоже часто  бывает, находятся пути обхода этих сложностей. В частности, модифицированные олигонуклеотиды, содержащие серу в сахаро-фосфатном остове вместо кислорода, так называемыке фосфотиоаты , оказываются устойчивыми к разрушительному действию ферментов в организме. В настоящее время они проходят клинические испытания, как средства лечения различных заболеваний. В результате надеются получить информацию относительно безопасности и эффекиивности модифицированных олигонуклеотидов, которая, возможно, позволит создать более совершенные конструкции.

Многие болезни крови связаны  с унаследованными мутациями. Так, замена одного нуклеотида ведет к  появлению гемоглобина S и развитию серповидноклеточной анемии . Точечные мутации лежат также в основе наследственных иммунодефицитов , например тяжелого комбинированного иммунодефицита вследствие недостаточности аденозиндезаминазы .

Введение в стволовые клетки крови генов, восстанавливающих нормальную функцию клеток, должно оказывать лечебное действие - например, введение гена аденозиндезаминазы может обеспечить нормальное развитие Т- и В-лимфоцитов. Широкому применению этого метода сегодня мешает несколько сложностей, одна из которых - слабая и непродолжительная экспрессия введенных генов в клетках крови.

То, что мы рассказывали во введении про девочку, представляет собой пример лечения одной из наследственных болезней метаболизма - недостаточности аденозиндезаминазы. Примерынаследственных болезней метаболизма многочисленны. О некоторых вы наверняка много раз слышали: фенилкетонурия, галактозэмия, семейная гиперхолестеролэмия, уже упоминавшийся синдром Леша-Нихана. Они связаны с дефицитом того или другого фермента, возникающим вследствие повреждения соответствующего гена. Как правило, эти болезни встречаются не часто, но следствия их крайне неприятны. Они в большинстве своем рецессивны.

Пример с аденозиндезаминазой показывает, как недостаток всего одного фермента приводит к острой иммунной недостаточности вследствие того, что в процессе метаболизма пуринов накапливаются токсичные промежуточные продукты, аденозин и 2'-дезоксиаденозин, которые селективно уничтожают Т-клетки . Генно-терапевтическая стратегия в этих случаях облегчается тем, что обычно для нормального существования организма не обязателен 100% нормальный уровень фермента, отсутствующего у больного. Уровень фермента 5- 25% от нормы часто вполне достаточен для совершенно здорового существования.

Например, гемофилия В , происходящая от резкой недостаточности сериновой протеазы,фактора свертывания крови IX , протекает в очень острой форме, если больные имеют менее 1% этого фермента от нормы. Но те, которые имеют от 1 до 10%, чувствуют себя вполне удовлетворительно. Поэтому можно достаточно просто осуществить пополняющую генную терапию. Особенно учитывая рецессивность большинства дефектов метаболизма.

Генотерапия фетальная

Большинство методов фетальной  генотерапии разработаны на трансгенных  мышах. Чужеродную ДНК вводят в оплодотворенные  яйцеклетки, полученные от мышей, у  которых была искусственно стимулирована овуляция. Затем яйцеклетки имплантируют в матку приемной матери. С помощью этого метода удалось заметно улучшить состояние мышей с наследственным дефицитом СТГ ,наследственным дефицитом основного белка миелина и наследственным дефицитом бета-цепи глобина . В подобных экспериментах получена важная информация о регуляции экспрессии генов и патогенезе наследственных болезней.

Однако трансгенные животные получаются только из 15-20% яйцеклеток с инъецированной ДНК, причем лишь у 20-30% животных введенный  ген экспрессируется. Более того, из-за случайного встраивания чужеродной ДНК в геном есть опасность повреждения гена хозяина (инсерционный мутагенез), приводящего к дефициту белка или нарушению регуляции, что может стать причиной злокачественного новообразования .

Таким образом, фетальная генотерапия пока неприменима для лечения наследственных болезней человека. Однако методы, разработанные в экспериментах с эмбриональными клетками, можно использовать для пренатальной диагностики. Это дает очень много - разумеется, лучше выявить наследственное заболевание на ранней стадии внутриутробного развития, чем прибегать к такому рискованному и ненадежному пока методу, как введение чужеродной ДНК.

Генотерапия соматическая

Если фетальная генотерапия пока неприменима для лечения наследственных болезней человека, то соматическая генотерапия наследственных болезней проходит клинические испытания.

Есть разные методы введения чужеродной ДНК в клетки-мишени, и выбор  метода частично зависит от заболевания. Доставку генетического материала производят с помощью вирусных векторов ( ретровирусы , не способные к самостоятельной репликации; аденовирусы ;аденоассоциированные вирусы ; герпесвирусы и др.) или невирусных систем ( липосомы , конъюгаты ДНК-белок и ДНК-белок-дефектный вирус). Существуют два подхода: ex vivo - сначала генетический материал вводят в клетки, выращиваемые в культуре, а затем трансгенные клетки вводят реципиенту, и in vivo - вектор, несущий нужный ген, вводят непосредственно в организм реципиента ( рис. 67.2 ).

Первый подход особенно эффективен, если для доставки используют стволовые  кроветворные клетки и другие клетки, которые удается вырастить в культуре в больших количествах; второй же устраняет проблему введения значительного числа клеток в орган-мишень.

В любом случае важно учитывать  количественные стороны - какой уровень  экспрессии необходим для улучшения  состояния больного и достаточны ли уровень экспрессии в трансгенных клетках и их число.

При испытаниях соматической генотерапии  чаще всего используют вирусные векторы. Каждый из них имеет свои преимущества и недостатки.

Использование ретровирусных векторов , не способных к самостоятельной репликации, обеспечивает эффективное встраивание чужеродной ДНК в геном и постоянство генетических изменений. Однако эти векторы встраиваются только в делящиеся клетки, могут вызывать инсерционные мутации, дают сравнительно низкие титры рекомбинантного вируса, а экспрессия встроенного гена часто уменьшается до очень низкого уровня через несколько месяцев.

Аденовирусные векторы эффективно переносят гены как в делящиеся, так и в неделящиеся клетки, не встраиваются в геном, обеспечивают высокие титры рекомбинантного вируса и высокий уровень экспрессии вводимых генов. Однако используемые в настоящее время аденовирусные векторы вызывают неспецифическое воспаление и антивирусную реакцию клеточного иммунитета, что сокращает длительность экспрессии до недель или месяцев.

Таким образом, используемые сейчас вирусные векторы имеют существенные недостатки. Чтобы соматическая генотерапия стала эффективной, нужно значительно усовершенствовать вирусные векторы, как и другие системы доставки генов.

Число заболеваний, при которых  можно использовать соматическую генотерапию, растет. Опыт, накопленный при использовании  обычных методов лечения, следует учитывать и при разработке методов генотерапии. Важно учитывать патогенез заболевания, начинать лечение до развития необратимых повреждений, обеспечивать правильное и регулируемое взаимодействие нового белка (продукта вводимого гена) с другими элементами пораженной системы гомеостаза.

Клинические испытания методов  соматической генотерапии проводят не только при моногенных заболеваниях, но и при злокачественных новообразованиях, ВИЧ-инфекции и других заболеваниях.

Разрабатываемые методы лечения злокачественных новообразований включают:

- изменение опухолевых или здоровых  клеток больного, с тем чтобы  посредством стимуляции синтеза  цитокинов или других молекул  изменить реакцию организма на  злокачественное новообразование;