Методы изучения генетики человека

Близнецовый метод изучения генетики человека введен в медицинскую практику Ф. Гальтоном в 1876 г. Он позволяет определить роль генотипа и среды в проявлении признаков. Различают моно- и дизиготных близнецов. Монозиготные (однояйцовые) близнецы развиваются из одной оплодотворенной яйцеклетки. Монозиготные близнецы имеют совершенно одинаковый генотип, но могут отличаться по фенотипу, что обусловлено воздействием факторов внешней среды. Дизиготные (двуяй-цовые) близнецы развиваются после оплодотворения сперматозоидами нескольких одновременно созревших яйцеклеток. Такие близнецы имеют разный генотип, и их фенотипические отличия обусловлены как генотипом, так и факторами внешней среды.Монозиготные близнецы имеют большую степень сходства по признакам, которые определяются в основном генотипом. Например, они всегда однополы, у них одинаковые группы крови по разным системам (ABO, Rh, MN и др.)> одинаковый цвет глаз, однотипные дерматоглифические узоры на пальцах и ладонях и др. Эти фенотипические признаки и используются в качестве критериев диагностики зиготности близнецов.

Процент сходства близнецов по изучаемому признаку называется конкордантностью, а процент различия - дискордант-ностью. Так как монозиготные близнецы имеют одинаковый генотип, то конкордантность у них выше, чем у дизиготных. Для оценки роли наследственности и среды в развитии того или иного признака используется формула Хольцингера:

Н = КМБ(%) - КДБ(%) /100%-КДБ(%)

где Н - доля наследственности, КМБ - конкордантность монозиготных близнецов, КДБ -конкордантность дизиготных близнецов. Если результат расчетов по формуле Хольцингера приближается к единице, то основная роль в развитии признака принадлежит наследственности, и наоборот, чем ближе результат к нулю, тем больше роль средовых факторов.

Популяционно-статистический метод изучения генетики человека основан на использовании математического выражения закона Харди-Вейнберга, где р - частота встречаемости в популяции доминантного гена, q - частота встречаемости рецессивного гена, р2 - частота доминантных гомозигот, q2 - частота рецессивных гомозигот, a 2pq -частота гетерозигот. Сумма частот всех генотипов может быть принята за 1 (100%): р2 + 2pq + q2 = 1(100%). Метод позволяет определять частоту генов и генотипов в больших (свыше 4,5 тыс.) популяциях людей.

Цитогенетические методы. Цитогенетический метод основан на макроскопическом исследовании кариотипа.

Этапы исследования:

1)  культивирование клеток человека (чаще лимфоцитов) на искусственных питательных
средах;

2)  стимуляция митозов фитогемагглютинином (ФГА);

3)  добавление колхицина (разрушает нити веретена деления) для остановки митоза на
стадии метафазы;

4)  обработка клеток гипотоническим раствором, вследствие чего хромосомы
"рассыпаются" и лежат свободно;

5)  простое и дифференциальное окрашивание хромосом;

6)  изучение хромосом под микроскопом и фотографирование;

7)  вырезание отдельных хромосом и построение идиограммы.

В 70-е годы прошлого века были разработаны методы дифференциального окрашивания хромосом человека, которые показали, что каждая пара хромосом имеет свой специфический характер чередования неокрашенных, светло- и темноокрашенных дисков (Парижская классификация). Метод позволяет выявлять геномные (например, болезнь Дауна) и хромосомные (например, синдром кошачьего крика) мутации. В таких случаях кариотип больного обозначают следующим образом: количество хромосом, набор гетерохромосом, номер хромосомы, короткого или длинного плеча и избыток (+) или нехватка (-) генетического материала. Например, болезнь Дауна у мальчика: 47,XY,21 + ; синдром кошачьего крика у девочки: 46,ХХ,5р-.

Молекулярно-цитогенетические методы основаны на флюоресцентной гибридизации in situ (FISH). Для исследуемой хромосомы или ее участка готовят однонитевой участок ДНК, к которому присоединяют биотин и дигоксигенин. Такой "помеченный" участок ДНК называется зондом. На микроскопическом препарате in situ денатурируют хромосомную ДНК (взятую у больного) щелочной обработкой, то есть разрывают связи между двумя цепочками ДНК. Препарат обрабатывают зондом. Так как последовательность нуклеотидов зонда и соответствующего участка исследуемой хромосомы комплементарны, то зонд присоединяется к хромосоме. В этом участке происходит ренатура.-ция ДНК. Далее препарат обрабатывают стрептовидином (вещество, избирательно присоединяющееся к биотину) и антиди-гоксигениновым антителом (избирательно присоединяется к ди-гоксигенину). К этим веществам присоединяют флюоресцентные красители (родамин - красный цвет или флюоресцеин -зеленый цвет). В люминесцентном микроскопе хорошо видны окрашенные хромосомы на фоне неокрашенных. С помощью метода FISH можно определять локализацию генов в хромосомах и все хромосомные аберрации. В последнее время разработана методика применения этого метода для диагностики анеуплоидий в интерфазных ядрах.

Биохимические методы. Биохимические методы основаны на изучении активности ферментных систем либо по активности самого фермента, либо по количеству конечных продуктов реакции, катализируемой данным ферментом. Применяются хроматографические, флюорометрические, радиоиммунологические и некоторые другие методы. Они позволяют выявлять генные мутации - причины болезней обмена веществ (например, фенилкетонурии, серповидно-клеточной анемии). Они могут применяться и как экспресс-методы.

С помощью биохимических нагрузочных тестов можно выявлять гетерозиготных носителей патологических генов, например фенилкетонурии. Обследуемому человеку вводят внутривенно определенное количество аминокислоты фенилаланина и через равные промежутки времени определяют его концентрацию в крови. Если человек гомозиготен по доминантному гену (АА), то концентрация фенилаланина в крови довольно быстро возвращается к контрольному уровню (определяется до введения фенилаланина), а если он гетерозиготен (Аа), то снижение концентрации фенилаланина идет в два раза медленнее. Аналогично проводятся тесты, выявляющие предрасположенность к сахарному диабету, гипертонии и другим болезням.

Молекулярно-генетические методы. Эти методы позволяют анализировать фрагменты ДНК, находить и изолировать отдельные гены и их сегменты и устанавливать в них последовательность нуклеотидов. Метод клонирования ДНК позволяет изолировать отдельные гены или их части, создавать неограниченное количество их копий, транскрибировать и транслировать изолированные гены, что стало возможным благодаря

открытию ферментов-рестрик-таз. Эти ферменты "узнают" специфическую олигонуклеотидную последовательность в двухнитевой ДНК и разрезают ее в данном месте - сайте. Разные рестриктазы распознают различные последовательности нуклеотидов и разрезают ДНК в разных сайтах. В последние годы для получения достаточного количества фрагментов ДНК используется полимеразная цепная реакция -метод амплификации ДНК в условиях in vitro. В течение нескольких часов можно размножить ДНК в количестве, превышающем исходное в миллионы раз.

Методы гибридизации нуклеиновых кислот. После разрезания ДНК на фрагменты рестриктазами проводится их электрофорез на агарозном или полиакриламидном геле с целью разделения этих фрагментов. Далее осуществляется идентификация фрагментов ДНК.

Для выявления специфических фрагментов ДНК используется метод блот-гибридизации по Саузерну. Эта методика состоит из следующих этапов:

1)  после окончания электрофореза гели помещают в щелочной раствор для денатурации
фрагментов ДНК - получают одноцепочечные ДНК;

2)  одноцепочечные ДНК вымывают из геля на нитроцеллюлозный или нейлоновый
фильтры перпендикулярным поверхности геля током буфера; одноцепочечные фрагменты
ДНК фиксируют на фильтре;

3)  для визуального выявления нужных фрагментов проводят гибридизацию исследуемого
образца со специфическим по нуклеотид-ной последовательности меченным
радиоактивно или флюоресцентной меткой олигонуклеотидным синтетическим зондом;
радиоактивно меченные участки выявляют путем экспонирования фильтра с
рентгеновской пленкой (ауторадиография); флюоресцентные метки выявляют в
люминесцентном микроскопе.

Этот метод позволяет обнаружить единственный ген среди десятков тысяч. Гомологичные последовательности можно идентифицировать как полностью, так и частично. Различные модификации этого метода позволяют в клинике анализировать очень малые количества ДНК, взятые у больного.

Для успешного применения в практическом здравоохранении молекулярно-генетических методов необходимо создание библиотек радиоактивных зондов всех последовательностей ДНК генома человека, и в этом направлении уже немало сделано.

Методы генетики соматических клеток. Наибольший интерес для генетики человека представляет метод гибридизации клеток. В 1960 г. французский ученый Ж. Барский, выращивая в культуре клетки двух линий мышей, обнаружил, что некоторые из них по своим морфологическим и биохимическим свойствам оказались промежуточными между исходными родительскими клетками. Это были гибридные клетки. Такое спонтанное слияние соматических клеток в культуре ткани происходит довольно редко. В дальнейшем было установлено, что при введении в культуру клеток РНК-содержащего вируса парагриппа Сендай, инактивированного ультрафиолетом, частота гибридизации клеток значительно повышается. В смешанной культуре разных типов клеток образуются гетерокарионы - клетки, содержащие два ядра разных клеток в одной цитоплазме. Часть таких клеток способна размножаться митозом. После митоза из двуядерного гетерокариона образуются две одноядерные клетки, каждая из которых представляет собой синкарион - настоящую гибридную клетку, содержащую хромосомы обеих родительских клеток, то есть происходит объединение двух геномов.

Гибридизация возможна между клетками не только организмов разных видов (человек -мышь), но и разных типов (человек - комар). Синкарионы обычно удается получать при гибридизации в пределах класса. Например, гибридные клетки человека и мыши имеют 43 пары хромосом: 23 - от человека и 20 - от мыши. В дальнейшем происходит постепенное удаление хромосом того организма, клетки которого имеют более медленный темп размножения. У гибридных клеток человека - мыши удаляются хромосомы человека.

В гибридных клетках функционируют хромосомы как человека, так и мыши, гены которых детерминируют синтез соответствующих белков. Морфологически можно отличить каждую из хромосом (дифференциальное окрашивание). Если в гибридной клетке отсутствует какая-либо хромосома и не происходит синтез каких-то белков, то можно предположить, что гены, детерминирующие синтез этих белков, локализованы в ней. Таким образом, этот метод позволяет устанавливать группы сцепления у человека, а используя нехватки и транслокации, - выяснять и последовательность расположения генов, то есть строить генетические карты хромосом человека.

Экспресс-методы - это быстрые предварительные методы изучения генетики человека. Они часто используются для исследования больших контингентов людей с целью выявления наследственной патологии как скрининг-методы, применяемые при проведении просеивающих программ. Например, скрининг новорожденных на фенилкетонурию, гипотиреоз, беременныхна альфа-фетопротеин, при помощи которого можно пренатально определить у плода некоторые пороки развития (например, анэнцефалию, открытые формы спинномозговых грыж, синдром Дауна).

К этим методам предъявляются определенные требования:

1)   метод должен быть диагностически значимым, то есть положительные и отрицательные
результаты должны соответствовать наличию или отсутствию заболевания;

2)   метод должен быть надежным: один и тот же образец при независимой двукратной
проверке должен одинаково оцениваться;

3)   исследованию должен подвергаться легкодоступный материал (кровь, моча) в малых
количествах (например, пятна капиллярной крови, высушенной на фильтровальной
бумаге);

4)   метод должен быть приемлемым для обследуемых, исполнителей и врачей;

5)   метод должен быть экономичным.

Микробиологический ингибиторный тест Гатри позволяет выявлять некоторые биохимические нарушения у новорожденных. Из пятки новорожденного берут кашпо крови на диски фильтровальной бумаги, которые помещают на агаровую культуру В. subtillis. Последнюю выращивают на минимальной питательной среде, содержащей антиметаболит искомой аминокислоты (например, фенилаланина). Антиметаболит должен одновременно тормозить рост микроба. При наличии в крови младенца большого количества фенилаланина антиметаболит разрушается и микробы начинают бурно расти. Меняя антиметаболиты, можно диагностировать наличие в крови определенных аминокислот и углеводов (лейцина, гистидина, фруктозы, галактозы и др.).

Биохимические и микробиологические экспресс-методы (флюорометрические, хроматографические, радиоиммунологические и др.) широко используются для быстрой предварительной диагностики наследственных болезней обмена веществ. Выявление Х- и Y-хроматина чаще осуществляется посредством соскоба клеток слизистой оболочки щеки (буквальный эпителий). Для выявления Х-хроматина мазки окрашивают ацеторсеином (или любой другой ядерной краской) и препараты просматривают в обычном световом

микроскопе. Этот метод позволяет определить количество Х-хромосом в кариотипе по количеству телец Барра (их на одну больше, чем количество глыбок Х-хроматина).

Для выявления Y-хроматина мазки окрашивают 0,005% раствором акрихин-иприта и просматривают в люминесцентный микроскоп - Y-хромосома дает яркое зеленое свечение. Этот метод позволяет установить количество Y-хромосом в кариотипе.

Методы пренаталъной диагностики наследственных болезней. Пренатальная диагностика связана с решением ряда биологических и этических проблем до рождения ребенка, так как при этом речь идет не об излечении болезни, а о предупреждении рождения ребенка с патологией, не поддающейся лечению (обычно путем прерывания беременности с согласия женщины). При современном уровне развития пренатальной диагностики можно установить диагноз всех хромосомных болезней, большинства врожденных пороков развития, энзимопатий, при которых известен биохимический дефект. Часть из них можно установить практически в любом сроке беременности (хромосомные болезни), часть - после 12-й недели (редукционные пороки конечностей, атрезии, анэнцефалию), часть - только во второй половине беременности (пороки сердца, почек).

Показания для пренатальной диагностики: наличие в семье точно установленного наследственного заболевания; возраст матери старше 37 лет; носительство матерью гена Х-сцепленно-го рецессивного заболевания; наличие в анамнезе у беременных спонтанных абортов в ранние сроки беременности, мертворож-дений неясного генеза, детей с множественными пороками развития и с хромосомной патологией; наличие структурных перестроек хромосом (особенно транслокаций и инверсий) у одного из родителей; гетерозиготность обоих родителей по одной паре аллелей при патологии с аутосомно-рецессивным типом наследования; беременные из зоны повышенного радиационного фона.

В настоящее время применяются непрямые и прямые методы пренатальной диагностики. При непрямых методах обследуют беременную (акушерско-гинекологические методы, сыворотка крови на альфа-фетопротеин); при прямых - плод. К прямым неинвазивным (без хирургического вмешательства) методам относится ультрасонография; к прямым инвазивным (с нарушением целостности тканей) - хорионбиопсия, амниоцентез, кордоцентез и фетоскопия.