Широкое
распространение получила методика
негативного контрастирования вирусов
с помощью вольфрамофосфорной кислоты
(Н3РW12О40), которая при
подщелачивании едким калием или едким
натрием (от значения рН 2,0 до рН 7,0) изменяется
и после нанесения препарата на вирус
создает зону высокого рассеивания электронов,
в результате чего выявляются морфологические
признаки вируса.
Развитию
знаний о структуре вириона способствовали
криогенные методики. Один из простейших
вариантов таких методик заключается
в следующем: сетки с подложкой
и находящимися на них вирусами после
нанесения контрастирующего раствора
помещают в сжиженный пропан (температура
-150˚) или переохлажденный азот (температура
-200˚). Дальнейшее высушивание образца
при температуре -100˚ в глубоком вакууме
способствует сохранению трехмерной организации
вириона. Исключение в этих условиях деформирующей
роли сил поверхностного натяжения воды
привело к пересмотру точки зрения, что
форма вириона у липидосодержащих вирусов
обладает высокой лабильностью. Более
сложные криогенные методики, применяемые
в электронной микроскопии (например,
криоскалывание), также внесли заметный
вклад в развитие представлений о структуре
вирионов, особенно об имеющих липопротеидную
оболочку.
Структура
генома вирусов изучается с помощью
модифицированной в 1959 году Клейштейном
и Лангом методики оттенения линейных
макромолекул тяжелыми металлами, которые
испаряются с В-образным катодов под углом
в 5-10˚.
Условием,
позволяющим изучить нуклеиновые
кислоты, и особенно однонические (поперечный
размер 1-1,1 нм), является связывание их
с основными белками, т.к. при этом образующийся
нуклеопротеид имеет диаметр до 18 нм в
двунитчатых структурах и до 15 нм – в однонитчатых.
В качестве такого белка чаще используют
цитохром С. Помещенная на подложку нуклеиновая
кислота в белковом чехле имеет самый
причудливый контур, и возможность увидеть
ее на всем протяжении осуществима только
в том случае, если во время оттенения
металлами будет совершен хотя бы один
поворот сетки с объектом для напыления
на 360˚. Лучшие результаты достигаются
при длительном оттенении (до 10 минут)
сплавом платины с палладием и многократном
поворачивании напыленной сетки на вращающемся
столике.
Многочисленные
модификации методики Клейшмидта и
Ланга позволяют получать данные
не только о длине генома, но изучать и
степень гомологии генома различных вирусов,
локализовать вставку того или иного гена
в состав гибридных молекул, исследовать
гибридные молекулы нуклеиновых кислот.
Общая
информация о морфогенезе вирусов
получена с помощью ультратонких
срезов вирусов. Техника получения
ультратонких срезов вирусов не отличается
от общепринятой.
В
последние годы возрастает удельный
вес ЭМ как экспресс-метода или
диагностики вирусных инфекций. Особенно
велика роль метода иммунной микроскопии,
позволяющего установить родовую принадлежность
вируса.
Иммунная
ЭМ сыграла решающую роль на первых этапах
исследования инфекционного гепатита
(гепатита А), а также вирусных гастроэнтеритов
и внесла существенный вклад в изучение
гепатита В.
Теоретические
основы иммуноморфологии на светооптическом
уровне разработаны в 1942 году Кунсом
с сотрудниками, которые впервые показали,
что в молекулу антитела можно ввести
некоторые вещества, не нарушая существенно
их специфичности. Развитие этой идеи
позволило в 1959 году Зингеру разработать
иммунноморфологический метод на электронномикроскопическом
уровне, основанный на использование антител,
меченных ферритином. Ферритин-белок с
высоким содержанием железа, в котором
атомы металла организованны в 4 субъединицы,
расположены близко друг к другу, что обеспечивает
высокое рассеивание электронов при ЭМ
и четкое выявление молекулы.
Конъюгация
белка с антителом возможна с
помощью различных бифункциональных
агентов, наибольшее распространение
среди которых получили 3,4-толуендиизоцианат
и ксиленметадиизоцеанат. Иммунная электронная
микроскопия с помощью антител, меченных
ферритином, эффективна для выявления
экстрацеллярных антигенов микробов в
инфицированных тканях, в том числе вирусных
антигенов на поверхности клетки, а также
поверхностных антигенов в клетке. Вместе
с тем эта методика в ряде случаев неэффективна,
например, если необходимо исследовать
внутриклеточные объекты, антигены микробов
внутри клетки, что имеет место, в первую
очередь, при вирусных инфекциях. Это обусловлено
тем, что молекулярный вес (масса) антител,
меченных ферритином, около 800 тыс., и поэтому
проихождение их через плазматическую
мембрану клетки невозможно, а антитела,
меченные ферритином, проникшие через
нее путем эндоцитоза не вступают в контакт
со специфическим антигеном. Поэтому основная
масса исследований, связанная с выявлением
внутриклеточных антигенов с помощью
антител, меченных ферритином, выполнена
при разрушении плазматической мембраны
путей замораживания-оттаивания или обработки
комплиментом. Замена ферритина низкомолекулярными
соединениями, содержащими ртуть, йод,
не нашла широкого применения из-за низкой
специфичности метода.
С
конца 60-ых годов 20-го века в иммунологии
применяется иммуннопероксидазная
методика ЭМ для обнаружения антигенов
внутри и на поверхности клеток. Перексидаза,
используемая для метки антител, позволяет
получить наилучший эффект по сравнению
с другими ферментами (фосфотазы, некоторые
оксидазы) благодаря более низкому молекулярному
весу (около 40 тыс) и устойчивости к различным
гистологическим процедурам. Антитела,
меченные пероксидазой, проникают в клетку
и связываются с гомологичным антигеном.
Конъюгирование антител с ферментом осуществляется
рядом бифункциональных агентов, среди
которых наиболее доступным является
глутаровый альдегид. После того как произошла
связь антитела с соответствующим антигеном,
локализация фермента выявляется после
контакта его с соответствующим субстратом
– бензидином, а-нафтолом, смесью а-нафтола,
с р-ферментом. В присутствии перекиси
водорода образуется продукт с более выраженной
рассеивающей способностью электронов
по сравнению с окружающими структурами.