Усилители биопотенциалов

     Принципиально внеклеточные усилители не отличаются от внутриклеточных усилителей для регистрации потенциалов. Но входные характеристики регистрирующей головки должны быть достаточно хорошие (соотношение сигнал шум, входная емкость и.т.п.) в связи  с тем, что амплитудно-временные параметры отводимых токов отличаются от внутриклеточных потенциалов.

     Внеклеточные токи меньше по амплитуде и имеют более быстрые передние фронты. Зачастую внеклеточные усилители имеют встроенный фильтр по постоянному току, что делает невозможным использование их для внутриклеточных экспериментов.

     На  что нужно обратить особое внимание при выборе внеклеточного усилителя:

     Входное сопротивление усилителя должно быть не менее, чем в 1000 раз больше сопротивления рабочего электрода.

     Убедиться, что параметры регистрируемого  сигнала укладываются в диапазон усилителя.

     Для корректной регистрации быстрых сигналов необходимо наличие компенсация емкости электрода

     Убедиться, что усилитель может работать с теми электродами, которые вы собираетесь  использовать (высокоомные или низкоомные).

     Наличие измерителя сопротивления электрода  позволяет оценивать качество электрода.

     Калибратор  позволяет контролировать параметры  регистрирующего электрода.

     Возможность инъекции тока позволяет ионофоретически  апплицировать вещества через электрод.

     Убедиться, что величина регистрируемого сигнала  после усиления (на выходе прибора) укладывается в диапазон Вашего самописца, регистратора или АЦП.

     Обратить  внимание на количество каналов, если есть необходимость вести регистрацию  в многоканальном режиме.

     Внеклеточный  усилитель биопотенциала ЕХТ-02F оснащен двумя дифференциальми входами с высоким сопротивлением входа через гнезда штекерого типа (Banana jacks), байонетные разъемы (BNC) или (по требованию) поставляется с внешними преобразователями входного сопротивления.

     Напряжение  сигнала на выходе может считываться  в режиме переменного тока (с усилением до х1000), либо в режиме постоянного тока с десятикратным усилением. ЕХТ-02F оформлен в настольный металлический корпус и снабжен внешним источником питания.

     Контроль  за параметрами усилителя облегчается  наличием двух светодиодных индикаторов, которые указывают на выход усилителя из линейного режима, а также аналоговым монитором баланса усилителя. Кроме того, ЕХТ-02F снабжен аудиомонитором что позволят контролировать записываемый сигнал акустически. ЕХТ-02F также производится в одноканальной версии.

     

Рисунок 3 - внеклеточный усилитель биопотенциала ЕХТ-02F

     Дифференциальные  усилители серии DP-300 для постоянного/переменного  тока предназначены для записи ЭЭГ, ЭКГ и регистрации внеклеточных сигналов.

     Особенностями этих усилителей являются высокое входное сопротивление, высокая степень подавления синфазных сигналов [100 dB ; 60 Hz], низкий уровень шума, высокая степень усиления, высокая устойчивость к постоянному току и фильтрация полосы частот.

     

Рисунок 4 - Дифференциальный усилитель DP-301 (одноканальный)

     

Рисунок 5 - Дифференциальный усилитель DP-304 (четырехканальный)

     Модульная система EPMS-07 предназначена для измерения  и/или обработки биоэлектрических сигналов в электрофизиологических экспериментах и испытаниях фармакологически активных веществ.

     Возможные компоненты системы EPMS-07:

• Усилители внутриклеточных сигналов
• Усилители внеклеточных сигналов
• Усилитель ELC (Extracellular loose clamp amplifier)
• Модули для фильтрации/обработки сигнала
• Коммутационные модули (“breakout box” modules)
• Измерители напряжения и тока
• Изолятор стимулирующих импульсов
• Модуль для введения химических веществ
• Модуль усилителя высокого напряжения
• Модуль для пермеабилизации клеток (“cell penetration module”)
• Таймер
• Звуковой монитор
• Измеритель сопротивления электродов

     

Рисунок 6 - модульная система EPMS-07

     Усилители для patch-clamp 

     Метод локальной фиксации потенциала, patch-clamp (англ. patch - заплатка, clamp здесь - захват, фиксация) - электрофизиологическая методика для изучения свойств ионных каналов, состоящая в том, что фрагмент клеточной мембраны изолируется с помощью специальной пипетки. Эта методика дает возможность экспериментатору контролировать разность потенциалов между сторонами мембраны, а также помещать ее в среду с определенным химическим составом.

     В этих хорошо контролируемых условиях измеряют ионные токи, проходящие через  мембрану, что, в конечном итоге, позволяет  делать выводы о том, как ионные каналы реагируют на электрическое и  химическое воздействие.

     Метод настолько чувствителен, что позволяет наблюдать поведение и химические превращения единичных молекул, взаимодействующих с мембраной.

     Ключевые  параметры, на которые  стоит обратить внимание при выборе прибора:

     Соответствие      возможностей усилителя методам, которые Вы планируете использовать.

     Обратить      внимание, что к выбранному усилителю имеются подходящие головки.

     Убедиться,      что диапазон фиксации напряжения и компенсация потенциала пипетки      достаточны для Ваших задач.

     Обратить      внимание на предельные возможности компенсации емкости и сопротивлений.

     Убедиться      в совместимости прибора с уже имеющимся оборудованием.  
 
 
 
 
 

3. ВОЗНИКАВШИЕ ТЕХНИЧЕСКИЕ ПРОТИВОРЕЧИЯ И ПУТИ ИХ ПРЕОДОЛЕНИЯ

     Фиксация  трансмембранного потенциала позволяет измерять мембранную проводимость по изменениям тока при постоянном напряжении. Суть метода состоит в следующем. В клетку вводятся два электрода, ещё один — электрод сравнения — остаётся вне клетки. Первый внутриклеточный электрод служит для измерения трансмембранной разности потенциалов (то есть разности потенциалов между ним и электродом сравнения), второй может подавать ток.

     Специальное устройство — генератор сигнала — задаёт командный потенциал, которому должен быть равен трансмембранный потенциал.

     Измеренный трансмембранный потенциал подаётся через усилитель на вход устройства сравнения, которое вычитает измеренный потенциал из командного и, в зависимости от величины разности, подаёт ток на токовый электрод так, чтобы скомпенсировать эту разницу. Монитор тока, в свою очередь, постоянно измеряет величину тока, которая для этого необходима. [4]

     В конце семидесятых годов XX в. Эрвин Неер (E.Neher) и Берт Сакман (B.Sakmann) обнаружили, что конусообразные стеклянные пипетки с диаметром кончика 1—2 микрона могут образовывать контакты с клеточной мембраной (границе «мембрана — стекло») с сопротивлением в несколько гигаом — это так называемый гигаомный контакт. Он позволяет изолировать от внешней среды и от остальной части мембраны тот её фрагмент, который находится внутри пипетки. Отграниченный пипеткой фрагмент мембраны и называется patch — «фрагмент», слово clamp (фиксация). В пипетку, заполненную раствором электролита, помещается хлор-серебряный электрод, второй электрод размещается внеклеточно, в омывающей жидкости.

     

     Рисунок 7 - Блок управления patch-clamp установкой. На мониторе видна пипетка, касающаяся поверхности клетки

     Огромная  сфера, часть которой видна на мониторе в центре фотографии — это клетка (ооцит лягушки Xenopus laevis), находящийся в данный момент на предметном столике микроскопа, к нему подведена patch-пипетка, её диаметр у носика — около 3 микрон. После установления гигаомного контакта она изолирует фрагмент мембраны.

     Если  по условиям эксперимента необходимо менять состав внеклеточной среды, можно  использовать конфигурацию whole cell («англ. целая клетка»). В этом случае пипетку не отводят от клетки, а подают в неё отрицательное давление и таким образом разрушают изолированный фрагмент мембраны.

     

     Рисунок 8 -  Принципиальная схема patch-clamp в конфигурации whole-cell.

     Поскольку клетка обычно маленькая, то, благодаря диффузии, состав цитоплазмы вскоре оказывается идентичным составу пипеточного раствора. Отметим, что если в конфигурации inside-out пипеточный электрод был «внеклеточным», а внутренний — «внутриклеточным», то теперь они поменялись ролями. С точки зрения изучения тока через каналы, преимущество этого метода состоит в том, что здесь оказываются сохранны клеточные структуры и регуляторные механизмы. Но при таком методе есть и недостаток — возможно измерить только суммарный ток всех каналов в клетке, а не токи через одиночные каналы.

     Решить  эту проблему позволяет  конфигурация outside-out (наружная сторона снаружи). Если после перехода в whole-cell mode медленно отводить пипетку от клетки, мембрана не отрывается сразу, а начинает вытягиваться в трубку — это видно на рисунке 9.

     

Рисунок 9 - Начальная фаза перехода из Whole-cell в Outside-out.

     Perforated patch («перфорированный patch»[7])— это специфический вариант patch-clamp в whole-cell mode. В данном случае, в пипеточном растворе содержится небольшое количество специального антибиотика. Антибиотики этого класса формируют ионные каналы в клеточной мембране на участке, присоединённом к микропипетке.

     Такой подход позволяет  избежать замещения  внутренней среды  клетки раствором  из пипетки-электрода, то есть клетка остаётся живой с минимальными, насколько это  возможно, повреждениями. Таким образом, ответы клетки на раздражители являются максимально  приближёнными к естественным.

     В то же время, данному  методу присущ ряд  недостатков. Во-первых, по сравнению с  классическим whole-cell mode, входное электрическое сопротивление (которое состоит главным образом из сопротивления пипетки и сопротивления в месте соединения пипетки с мембраной) является значительно более высоким.

     Это понижает качество фиксации потенциала, повышает уровень шума при  записи, и увеличивает  значения всех ошибок, связанных с изменениями  сопротивления полной цепи (от электрода  во внешнем растворе до электрода в  пипетке). Во-вторых, для того, чтобы антибиотик подействовал, требуется довольно много времени (до 30 минут), что существенно уменьшает полезный период эксперимента. И, в-третьих, антибиотик повреждает мембрану также и в месте соединения с кончиком пипетки, что приводит к ускоренному разрушению гигаомного контакта и дополнительно уменьшает эффективное экспериментальное время. Чтобы решить данную проблему, данный вариант метода используют только в экспериментах, которые не требуют продолжительного времени для изучения исследуемых явлений.