Тонкослойная хроматография

Тонкослойная хроматография  – способ анализа (реже препаративного разделения) смесей жидких или твердых  веществ, основанный на различном сродстве разделяемых веществ к неподвижной (сорбент) и подвижной (элюент) фазам. Как правило, чем лучше вещество сорбируется неподвижной фазой - тем медленнее вещество двигается  по пластине. Тонкослойная хроматография  чрезвычайно чувствительный метод, позволяет обнаруживать до ~0.5 масс.-% примесей.

Область применения

Анализ смесей жидких или твердых веществ, различающихся  по Rf.

Анализ реакционных  смесей, мониторинг протекания химических реакций.

Мониторинг проведения колоночной хроматографии и контроль чистоты отбираемых фракций.

Определение чистоты  конечного продукта.

Оборудование 

Типичный прибор для проведения ТСХ анализа приведен на рисунке:  

Капилляр. Представляет собой стеклянную трубку с внутренним диаметром 0.3-1.0 мм, вытянутую в пламени (см. Видеоурок по вытягиванию капилляра, Важно! Оба конца капилляра должны быть открыты). Края капилляра должны быть ровными, чтобы не царапать слой сорбента и при легком прикосновении  переносить раствор вещества на пластину. Важно! Чем уже капилляр, тем легче  получить небольшое пятно вещества на пластине. В качестве капилляра  также удобно использовать насадки  для пипетмана (см. фото выше).

Ёмкость для ТСХ. Химический стакан с плоским дном, на дно которого наливается элюент слоем 4-6 мм. Для воспроизводимых  результатов дно и стенки емкости  выкладываются фильтровальной бумагой, которая пропитывается элюентом. Емкость закрывается крышкой (или  чашкой Петри, часовым стеклом) для  избежания испарения элюента.

Элюент.

Требования к элюенту (см. Подбор элюента и сорбента для  тонкослойной (ТСХ) и колоночной (КХ) хроматографии

).

Выделяемые вещества не должны взаимодействовать с элюентом или разрушаться в его присутствии. Пример: гидролиз эпоксидов или ацеталей водой на силикагеле.

Элюент может быть или индивидуальным растворителем  или смесью нескольких растворителей. Растворители должны легко удаляться  после проведения анализа (поэтому  диметилсульфоксид (ДМСО) или диметилформамид (ДМФА) не подходят из-за высокой температуры  кипения).

Элюент подбирают  таким образом, чтобы пятно целевого вещества выходило с Rf не более 0.5-0.6 после  одного прогона хроматограммы и  было хорошо дифференцировано от примесей (~0.1 Rf). Если на старте остались еще вещества (Rf = 0, "сидят на старте"), следует сменить элюент и проанализировать состав этой смеси. Иногда целевое вещество может "сидеть на старте".

Если под действием  растворителей различной полярности (полярных (метанол, возможно с добавлением  уксусной кислоты или триэтиламина) и неполярных (гексан, пентан)) вещество не сдвигается со старта или двигается  с фронтом, следует перейти к  другому сорбенту.

Пример: Rf = 0, так ведут  себя высоко полярные вещества (ионные жидкости, амины) на силикагеле; или  неполярные вещества на сорбентах с  обращенной фазой.

Пример: Rf = 1, так ведут  себя неполярные вещества на силикагеле; или высоко полярные вещества (ионные жидкости, амины) на сорбентах с обращенной фазой. Ряд растворителей по полярности см. здесь

.

Количество элюента. Элюент наливается в емкость до образования  слоя 4-6 мм. Важно! Пластину погружают  в элюент так, чтобы пятна веществ  не соприкасались непосредственно  с элюентом, иначе произойдет вымывание  веществ в элюирующую смесь.

Сорбент. Выбирается исходя из свойств разделяемой смеси.

Требования к сорбенту.

Разделяемые вещества не должны разрушаться в присутствии  сорбента. Пример: разделение и очистка  ацеталей на силикагеле (у него кислая реакция) практически невозможна из-за их разрушения. В то время как  на нейтральном Al2O3 их удается эффективно разделить.

См. также как с  помощью ТСХ определить разлагается  ли вещество на данном сорбенте

.

Если под действием  растворителей различной полярности (полярных (метанол, возможно с добавлением  уксусной кислоты или триэтиламина) и неполярных (гексан, пентан)) вещество не сдвигается со старта или двигается  с фронтом, следует перейти к  другому сорбенту (от полярного сорбента к неполярному и наоборот).

Пример 1: Rf = 0, так  ведут себя высоко полярные вещества (ионные жидкости, амины) на силикагеле; или неполярные вещества на сорбентах  с обращенной фазой.

Пример 2: Rf = 1, так  ведут себя неполярные вещества на силикагеле; или высоко полярные вещества (ионные жидкости, амины) на сорбентах  с обращенной фазой.

Пластина.

Ширина пластины определяется: по 5 мм от краев пластины, и 4-6 мм расстояние между пятнами. Длина  пластины: от 5 см (для хорошо разделяющихся  веществ) до 10 см или более (для сложных  смесей).

Линия "старта" проводится карандашом на расстоянии 5-7 мм от нижнего края пластины, с  этого же края отрезаются уголки (~2 мм) для того, чтобы фронт элюента  шел по пластине ровным слоем.

Вещество наносится  на пластину в виде раствора с достаточно небольшой концентрацией (иначе  возможна "перегрузка пластины", т.е. вещества будут выходить длинной  растянутой линией, не разделяясь) при  помощи капилляра. Диаметр пятен 3-5 мм. При мелких пятнах <2 мм вещество на пластине сильно концентрировано, в  результате - плохое разделение. При  больших пятная >6 мм - вещество сильно размывается при элюировании  затрудняя дифференциацию пятен.

При анализе фракций  колоночной хроматографии. Пятна нумеруют. Если все фракции не помещаются на одну пластину, то последняя фракция  с предыдущей пластины также наносится  на текущую пластину - для сравнения.

Пример: на 1 пластине наносят фракции с 1 по 10, на второй с 10 по 19, на третьей с 19 по 28 и т.д.

Линия "финиша" проводится карандашом после окончания  элюирования на расстоянии 3-5 мм от верхнего края пластины. Важно! Для  воспроизводимых результатов фронт  элюента не должен достигать края пластины.

Типичную ТСХ пластину после проведения анализа и проявления пятен можно посмотреть ниже:

Пример:

Посмотреть

Обнаружение пятен.

Большинство органических соединений не окрашены, т.о. не удается  визуально определить положение  пятен на пластине. Поэтому, после  проведения ТСХ анализа требуется  проявить пятна в ультрафиолетовом свете (УФ), йоде (I2) или под действием  специальных реагентов. Подробнее  читайте в разделе Обнаружение  веществ при тонкослойной (ТСХ) и  колоночной (КХ) хроматографии.

Рекомендации при  проведении

Если при помещении  пластины в емкость фронт элюента  пошел неровно, следует вынуть пластину, выровнять нижний край ножницами  и поместить пластину в емкость  снова. 

Для воспроизводимых  результатов элюент для каждого  ТСХ анализа следует готовить заново. Так как растворители испаряются.

Для тщательного  анализа смеси нескольких веществ  можно использовать градиентное  элюирование, т.е. (на примере хроматографии  на силикагеле), начинать элюировать неполярными  растворителями (пентан, гексан), далее  постепенно увеличивать полярность смеси (смеси: гексан/этилацетат от 20:1 до 1:5) и, наконец, переходить к высоко полярным растворителям и смесям (метанол, смеси метанол/триэтиламин 20:1).

Подбор элюента  и сорбента для тонкослойной (ТСХ) и колоночной (КХ) хроматографии

(Методика)

1. Подбор элюента  для тонкослойной хроматографии  (ТСХ). 

Так как наиболее часто используются пластины с силикагелем  в качестве сорбента разберем подбор элюента именно на них. Методика не отличается в случае окиси алюминия в качестве сорбента, и обратна  в случае сорбентов с обращенной фазой. 

Ключевым моментом при подборе растворителя является относительная полярность растворителей, которую можно посмотреть Здесь. 

На несколько пластин  длиной ~7 см и шириной ~1 см наносится  раствор разделяемой смеси (приготовление  ТСХ пластины см. раздел Тонкослойная хроматография).

Посмотреть результат 

Подбор элюента  начинают с наименее полярных растворителей, таких как н-гептан, н-гексан, н-пентан, циклогексан

Посмотреть результат

Верхнее вещество с Rf = 0.2 уже можно выделить в индивидуальном виде колоночной хроматографией. Часть  смеси осталось на старте, следует  продолжить подбор элюента для анализа  ее состава. Для этого следует  использовать более полярные системы. Например, смеси н-гексан/этилацетат (от ~10:1 до ~5:1), бензол, толуол, хлороформ.

Посмотреть результат

Теперь первое пятно  выходит почти с фронтом растворителя. На колонке оно выйдет в 1 - 2-ой фракциях. Наиболее эффективно удастся очистить 2 вещество с Rf = 0.4. Вещества с Rf = ~0.15 скорее всего поделить не удастся. Вещество (или смесь, пока не ясно) "сидящее  на старте" не выйдет с колонки. Так  как часть исходной смеси все  еще имеет Rf = 0 следует продолжить анализ. Переходим к более полярной смеси - н-гексан/этилацетат (от ~2:1 до чистого  этилацетата), хлористый метилен

Посмотреть результат

В выбранной смеси  на колонке уже не удастся разделить  первые 4 вещества, скорее всего, будут  получены смеси 1+2 и 3+4, однако, возможно, удастся выделить 5 вещество (хотя, скорее, оно захватит часть от 3+4) и, скорее всего, удастся выделить 6 вещество. Однако, часть смеси еще на старте. Переходим к сильно полярным растворителям: метанол, метанол + добавка кислоты (уксусная) или основания (триэтиламин), изопропанол, этанол и т.п.

Посмотреть результат

В выбранной смеси 1-5 вещества выходят с фронтом, 6 вещество уже не удастся выделить на колонке (оно выйдет вместе с 1-5 веществами), зато 7-е вещество удастся эффективно очистить. Так как на старте не осталось больше веществ - ТСХ анализ смеси  практически окончен.

Иногда удается  подобрать смесь растворителей  для смеси веществ, которые не разделялись в другой смеси. Хотя полярность обоих смесей, близка. Для  этого следует сравнивать элюенты  резко отличные по составу. Пример: н-гексан/этилацетат (А) или смесь  толуол/хлористый метилен (или хлороформ) (Б); метанол или этилацетат/триэтиламин  и т.п.

Посмотреть результат

Иногда компонент  смеси идет с фронтом элюента  уже в неполярном гексане. Или  не сдвигается со старта метанолом  с добавкой триэтиламина. В этом случае для его очисти необходимо использовать другой сорбент (обращенная фаза, сефадекс и т.д.).

2. Определение устойчивости  компонентов смеси на данном  сорбенте в данном элюенте  (двумерная тонкослойная хроматография).

На Пластину ТСХ (приготовление  см. раздел Тонкослойная хроматография) размерами 6 х 6 см в нижний левый  край на расстоянии 5 мм от обоих краев  наносят раствор вещества.

Посмотреть результат

Пластину элюируют найденным в 1 пункте этой статьи элюентом.

Посмотреть результат

Пластину высушивают при комнатной температуре в  течении 10-20 минут.

Пластину элюируют расположив вниз тем левым боком  вниз (в элюент).

Посмотреть результат

Высушивают пластину и проявляют.  

Если количество пятен не отличается от количества пятен при одномерном (обычной) тонкослойном хроматографическом анализе, значит вещество стабильно в выбранной системе (все пятна располагаются вдоль  диагонали пластины) (См. Вариант  А на рисунке выше). Если появляются "лишние" пятна (лежат не на диагонали  пластины) значит вещество не стабильно (См. Вариант Б на рисунке выше) и следует заменить или элюент (например, протонный на апротонный) или сорбент (кислый силикагель на нейтральную  окись алюминия).

Общие сведения 

Процесс подобен  бумажной хроматографии, но его преимуществом  является большая скорость анализа, более высокое качество разделения, и возможность выбора одной из неподвижных фаз, обладающих наиболее подходящими свойствами.

[править]

Техника

 

 Пластина с  нанесенными каплями образцов (смесь  красного и синего компонента) в процессе разделения

[править]

Варианты тонкослойной хроматографии