Спектрофотометрический метод анализа

  Существует ещё один способ идентификации, который заключается в. сопоставление спектров поглощения растворов соединении, полученных в результате химического превращения исследуемого и известного вещества. Совпадение формы спектра поглощения смеси по спектрам поглощения каждого из веществ подтверждает их идентичность.

Качественный анализ лекарственных средств на основании одних спектров поглощения в УФ области может привести к ошибкам. Поэтому параметры спектров поглощения приводят в качестве дополнительных критериев установления подлинности. Однако часто их рассматривают как основные критерии наряду с другими показателями. Поэтому необходимо всегда стремиться к увеличению объема информации в результатах спектрофотомегрических исследовании.

Идентификация будет  более надежной, если установить одинаковое влияние на спектры поглощения различных  факторов (растворителя, концентрации ионов водорода, температура и др.)

         1.3 Испытание на чистоту

Применение спектрофотометрии  в УФ области для проверки доброкачественности  фарм. препаратов является ценным в  случаях, когда примеси или продукты разложения поглощают в области, отличной от исследуемого вещества.

Указываемые в фармакопейных  статьях величины поглощения, определяющие предельное содержание примеси как  «не более», устанавливается эмпирическим путем.

          Таким путем определяют примесь адреналона, имеющего максимум при длине волны 310 нм в адреналине гидрохлориде, максимум поглощения которого при длине волны 278 нм.

ГФ10 ст. 25: оптическая плотность 0,05 % раствора препарата адреналина гидрохлорида в 0,01н растворе соляной  кислоты при 310 нм не должна превышать 0,1.

   Предел содержания поглощающих примесей может быть установлен по величине отношения поглощения при различных длинах волн.

Примеры: ГФ10 ст.192. Поглощение примеси цианакобаламина определяют по величине отношения оптических плотностей 0,003% раствора препарата при длинах волн 361 нм, 548 нм ,278 нм.   

 Д361/Д548=3,0-3,4 ;      Д361/Д278=1,7-1,88

ГФ10 ст.587. Примесь кверцетина в рутине определяют по величине отношений  оптических плотностей при длинах волн 375 нм, 362 нм.

Д375/Д362,5= Д.б. не более 0,879.

Количественный анализ

Метод спектрофотометрии  в УФ-области широко используется для количественного определения  лекарственных препаратов и их лекарственных  форм.

Идеальное вещество для  таких измерении должно иметь  четко выраженную полосу поглощения с широким максимумом и со значительной величиной поглощения при максимум.

Основным условием для  количественного анализа является соблюдение закона Бугера-Ламберта-Бера в пределах указанных концентраций.

 

 

2. Анализ однокомпонентных лекарственных средств.

 Приступая к методике спектрофотометрического определения лекарственного вещества, следует изучить его спектр поглощения в избранном растворителе.

Для этого определяют оптическую плотность  раствора на спектрофотометре в интервале  длин волн от 220 нм до 400 нм через каждые 5 нм. Для уточнения максимума и минимума поглощения, измерение следует проводить через 1 нм. По данным измерения строят график зависимости оптической плотности от длин волны.

 

λ (нм)| Д | λ (max) | λ (нм) | Д | λ (max) |

220 | 0,478 |  | 270 | 0,544 |  |

225 | 0,316 |  | 275 | 0,573 | λ (max) |

230 | 0,218 |  | 280 | 0,562 |  |

235 | 0,188 |  | 285 | 0,530 |  |

240 | 0,192 |  | 290 | 0,474 |  |

245 | 0,219 |  | 300 | 0,335 |  |

250 | 0,267 |  | 310 | 0,207 |  |

255 | 0,334 |  | 320 | 0,107 |  |

260 | 0,415 |  | 330 | 0,057 |  |

265 | 0,490 |  |  |  |  |

         λ (нм) |  Д | λ (max) | λ (нм) | Д | λ (max) |

270 | 0,544 |  | 275 | 0,570 |  |

271 | 0,550 |  | 276 | 0,571 | λ (max) |

272 | 0,558 |  | 277 | 0,570 |  |

273 | 0,561 |  | 278 | 0,569 |  |

274 | 0,565 |  | 279 | 0,563 |  |

            0 | 220 | 240 | 260 | 280 | 300 | 320 | 340 |

 

Изучив спектр исследуемого вещества, приступают к выбору волны  для проведения анализа.

Концентрацию вещества можно определить при любой длине волны и результаты д. б. одинаковыми, однако точную установку одной и той же длины волны производят с таким расчетом, чтобы при незначительных отклонениях изменение интенсивности поглощения было небольшим. В этом случае погрешность в отсчете длины волны не будет иметь существенного значения. Максимальная воспроизводимость рассчитывается обычно при измерениях поглощения в максимуме или минимуме широкой полосы. Здесь ошибка при установке длины волны на 1 -2 см почти не влияет на результат определения.

 Проверка   подчинения   поглощения   исследуемым   раствором    закону    Бугера-Ламберта-Бера может быть осуществлена двумя способами - расчетным и графическим.

Готовят серию стандартных  растворов с такой концентрацией. чтобы оптические плотности лежали в пределах 0,2-0,8 . При одной и той же длине волны, соответствующей максимуму поглощения данного вещества, определяют зависимость между концентрацией и оптической плотностью .

Для определения вещества, определяют зависимость между концентрацией  и оптической плотностью.

 № раствора | Концентрация, % | Оптическая плотность, Д |   Е1см1%  |

1 | 0.0005 | 0,122 | 244 |

   2 | 0.001 | 0,280 | 280 |

3 | 0.0015 | 0,403 | 272 |

   4 | 0,002 | 0,542 | 271 |

   5 | 0,0025 | 0,680 | 272 |

 

       Е1см1%  = Е1+Е2+Е3+Е4+Е56 = 275

А) расчетный метод  сводится к установлению показателя поглощения. Его вычисляют по формуле:

       Е1см1%  = ДС

Согласно закону Бугера-Ламберта-Бера, показатель поглощения данного вещества является величиной постоянной и  не зависит от концентрации. Поглощения растворов подчиняется закону Бугера-Ламберта-Бера только в границах концентраций, при которых числовые значения показателей поглощения являются постоянными или находятся в пределах допустимых отклонений.

Б) калибровочная кривая в границах этих концентраций представляет собой прямую линию. Точность метода зависит от наклона прямой: чем больше наклон, тем выше точность

2.1 Способы измерения концентрации

Наиболее точное измерение  интенсивности поглощения достигается  при пропускании /Т/ 36,8 %, что соответствует оптической плотности 0,484. Оптимальную концентрацию для анализа вычисляют по формуле:

С = ДЕ1см1% ×l                                     /Т/ = 0,434Е1см1% ×l

Наиболее точно измерения  при Т = 36,8 %  Д = 0,434

Иначе говоря, чтобы вычислить концентрацию вещества для анализа, следует 0.434 разделить на значение удельного показателя поглощения данного раствора вещества при избранной длине волны.

Концентрацию растворов  можно измерять несколькими методами:

   *  по удельному показателю поглощения;

   *  по стандартному образцу;

   *  по калибровочной кривой;

   *  методом дифференциальной спектрофотометрии и др.

Для количественного  определения с использованием удельного  показателя поглощения готовят раствор  определяемого вещества с концентрацией, которая находится в пределах подчинения законам светопоглощения. Оптическую плотность приготовленного раствора измеряют в максимуме поглощения.

Содержание препарата  в процентах (X1) или в граммах (Х2) вычисляют по формулам:

С = ДЕ1см1% ×l  (1)  Х1 = Д×УЕ1см1% ×a (2)  Х2 = Д×У×РЕ1см1% ×a×100

где     Д - оптическая плотность приготовленного раствора;

Е1см1%  - удельный показатель поглощения;

У - разведение;

а - навеска, или объем (г или мл);

Р - общая масса или  объем лекарственной формы.

Основным недостатком этого метода является общеизвестный факт, что различные спектрофотометры, даже одной и той же модели и одного производства дают значительные отклонения по величине поглощения одного и того же стандартного раствора.

По ГФ X этим методом  определяются: цианокобаламин: ст. 192. раствор ционокобаламина для инъекций: ст. 193.

2) Более достоверные  и воспроизводимые результаты  обеспечивают сравнение испытуемого  вещества с поглощением стандартного  образца, определенного в тех  же условиях.

Согласно положений  ГФX, спектрофотометрическое количественное определение содержания лекарственного вещества при анализе индивидуальных веществ должно быть связано с применением специально приготовленного стандартного образца этого вещества. Примерами являются стероидные вещества, включенные в ГФX (кортизона ацетат, тестостерона пропионат, преднизолон, прегнин). При количественном анализе лекарственных форм, если нет специальных указаний, допускается использовать в качестве стандартного образца вещество, отвечающее всем требованиям фармакопеи. При расчетах такой стандартный образец принимается за 100 %, если нет других указаний (адреналина гидротартрат в растворе для инъекций, аминазин, пропазин в драже, левомицетина стеарат, дипрофиллин, синэстрол, хингамин в таблетках).

Расчет количественного содержания индивидуального вещества в процентах (X) использовании стандартного образца производится по формуле:

Х1 = Д1×С0×У×100Д0×a  (4)

где До - оптическая плотность  раствора стандартного образца;

Д1 - оптическая плотность  испытуемого раствора;

Со - концентрация раствора стандартного образца;

 У - разведение;

а - навеска, г.

Содержание вещества в единой таблетке в граммах (Х2) считают  на среднюю массу таблетки. Рассчитывают по формуле:

Х2 = Д1×С0×У×РД0×a  (5)

где Р - средняя масса  таблетки.

Значение остальных  символов см. формулу 4. 

Недостаток этого метода - мало стандартов.

         Метод калибровочной кривой

Если количественное измерение выполняется достаточно часто можно вместо стандартного раствора образца использовать калибровочный  график, полученный для соответствующего стандартного образца. Таким графиком можно пользоваться, когда для  испытуемого вещества поглощение пропорционально концентрации в пределах 75-125 % от окончательной концентрации, используемой в количественном определении. Такие калибровочные графики надо часто проверять и каждый раз готовить заново для нового прибора и новой серии реактивов.

 

 

 

 

3 Дифференциальная спектрофотометрия

В последние годы для  расширения интервала определяемых концентраций и для повышения  точности анализа применяется так  называемая дифференциальная спектрофотометрия.

Ошибки при обычной спектрофотометрии  составляют примерно 2%. При дифференциальной спектрофотометрии величина относительной ошибки снижается до десятых долей процента.

Сущность метода состоит в том, что оптические плотности исследуемых  растворов измеряют не по отношению  к чистому растворителю с нулевым  поглощением, а по отношению к раствору определяемого вещества с концентрацией Со, близкой к концентрации Сх исследуемого раствора.

Дифференциальная спектрофотометрия  позволяет определять более высокие  концентрации.

Раствор цианокобаламина  для инъенкций.

Состав: Цианокобаламина 30, 100, 200 или 500 мг

Раствор натрия хлорида изотонического 0,9 %    до 1 л

Раствор фильтруют, разливают в  ампулы нейтрального стекла по 1 мл и  стерилизуют текучим паром при 1000в течение 30 минут.

Описание. Прозрачная жидкость от слабо розового до ярко-красного цвета.

Подлинность. 0,002 % раствор  препарата имеет максимум поглощения при 278 + 1 нм; и 548 + 2 нм.

Отношение  Д при 361 нмД при 548 нм  должно быть от 3,0 до 3,4

Отношение  Д при 361 нмД при 278 нм   должно быть от 1,7 до 1,88

Количественное определение. Препарат разводят водой до содержания около 0,02 мг цианокобаламина в 1 мл, измеряют оптическую плотность полученного раствора на спектрофотометре при длине волны 361 нм в кювете с толщиной слоя 1 см. В качестве контрольного раствора применяют воду.

Содержание цианокобаламина  в мг (X) препарата вычисляют по формуле:

Х = Д×10×У207×У1

где     Д - оптическая плотность испытуемого раствора;

207 - удельный показатель  поглощения Е чистого цианокобаламина  безводного при длине волны  361 нм;

У - объем препарата, взятый для разведения, в мл;

У1 - конечный объем раствора в мл.

Содержание цианокобаламина в 1 мл препарата соответственно должно быть 0,027-0,033 мг; 0,09-0,11 мг; 0,18-0,22 мг или 0,45-0,55 мг.

Хранение. В защищенном от света месте.

УФ-спектрофотометрия  с успехом используется не только для количественного определения  фармацевтических препаратов, но и для анализа сложных лекарственных смесей.

Анализ лекарственных  смесей методом УФ-спектрофотометрии  имеет ряд преимуществ перед  объемно-аналитическими определениями, из которых основные- быстрота выполнения анализа, малый расход лекарственной смеси на анализ, высокая чувствительность, точность и специфичность метода, что часто дает возможность определения без разделения двух ингредиентов смеси и т.д.