Промышленные процессы с использованием иммобилизованных ферментов и клеток

Процесс промышленного производства фруктозы, разработанный японской компанией  «Санматсу», состоит в следующем (Н. Ishikawa, 1977). Глюкозоизо-мераза экстрагируется из соответствующих микроорганизмов и адсорбируется на ионообменной смоле, специфической данному ферменту. Полученный таким образом иммобилизованный фермент помещают в колонну. Время полуинактивации этого фермента варьирует от 50 (при использовании кристаллической глюкозы) до 30 сут.

На рис. 2 приведена технологическая  схема процесса изомеризации глюкозы на венгерском заводе по переработке 120 тыс. т кукурузного зерна в год. В качестве катализатора используется иммобилизованная глюкозоизомераза «Така-свит». Объем слоя катализатора в реакторах колонного типа составляет 20 м³, общий расход иммобилизованного фермента — 35 т/год. Продуктивность процесса 2,5 т глюкозо-фруктозного сиропа на 1 кг иммобилизованного фермента  (J. Hollo, 1983, 1985).

Специалисты компании «Ново» (W. Carasik, J. О. Carroll, 1983) рекомендуют следующие параметры промышленного реактора для ферментативной изомеризации глюкозы (при активности иммобилизованного фермента 200 межд. ед/г и времени работы фермента — 2 периода полуинактивации): мощность производства — 400 т/сут (по сухому веществу); исходная концентрация глюкозного сиропа — 40%; средняя скорость подачи сиропа — 35,6 м³/ч; количество иммобилизованного фермента — 15 т; объем слоя иммобилизованного фермента — 50 м³; число реакторов, работающих параллельно, — 6; внутренний диаметр реактора— 1,45 м; высота слоя иммобилизованного фермента — 5 м; линейная скорость потока — 3,6 м/ч; расход иммобилизованного фермента — 220 кг/сут; операционный цикл — 275 ч.  

В начале 1980-х годов американской корпорацией «Ситус» разработан новый процесс получения 100%-ной  фруктозы из глюкозных сиропов. Процесс состоит из двух стадий — ферментативной и химической. На первой стадии глюкоза окисляется в £)-глюкозон под действием иммобилизованной пиранозо-2-оксидазы из Polyporus obttisus. На второй — глюкозой восстанавливается до фруктозы на палладиевом катализаторе. Выход фруктозы почти количественный.

Экономические оценки.

Быстрое увеличение производства глюкозо-фрукозных сиропов (см. с. 19) стало возможным благодаря возрастанию эффективности технологии иммобилизации глюкозоизомеразы и улучшению характеристик иммобилизованного фермента. Каждый значительный шаг на этом пути сопровождался снижением затрат при производстве глюкозо-фруктозных сиропов.

На рис. 3 дано сопоставление экономики  промышленного процесса на предприятии  компании «Киева Хакко» (Япония) с применением иммобилизованной на фенолформальдегидной смоле глюкозоизомеразы с процессом на основе растворимого фермента   (Y.   Yokote,   1975).   Для   периодического   процесса   с

Рис. 3. Сопоставление  затрат на производство глюкозо-фруктозного сиропа с использованием растворимой и иммобилизованной глюкозоизомеразы на предприятии компании «Киева Хакко» (Япония), (Y. Yokote, 1975)

использованием растворимого фермента на изомеризацию 1000 кг глюкозы расходуется 21 кг глюкозоизомеразного препарата. Из этого же количества ферментного препарата получается 9,8 л иммобилизованной глюкоизомеразы, которая катализирует изомеризацию 2822 кг глюкозы за 30 сут. В итоге стоимость процесса с иммобилизованной глюкозоизомеразой составляет 61,5% oт стоимости процесса с растворимым ферментом.

Еще один пример экономических  оценок при сопоставлении эффективности  ферментативной изомеризации глюкозы  под действием растворимого и иммобилизованного фермента по данным университета Пурдю (шт. Индиана, США), приведен в табл. 3 (Emery A., 1976). Как видно из таблицы, для процесса с растворимой глюкозоизомеразой основные затраты приходятся на получение фермента. Для процесса с иммобилизованным ферментом основные затраты идут на изготовление носителя и на реагенты для иммобилизации. По-видимому, в данном случае (как и для других процессов с использованием глюкозоизомеразы) эффективность применения иммобилизованного фермента по сравнению с растворимым объясняется главным образом высокой стоимостью последнего.

Экономические оценки, проведенные  в Венгрии в начале 80-х годов, показали, что производство глюкозо-фруктовых си-

 

Таблиц № 3. Экономические оценки процесса получения глюкоз-фруктозных сиропов производительностью  500 т  сухого  продукта  в  год   (A.   Emery,   1976)

	Глюкозоизомераза
Параметры	Периодический пропроцесс, рассрасстворимый фермент	Непрерывный пропроцесс, иммобилизованный " фермент
Время    реакции    (усл(основное) Оптимальная про  продолжительность реререакции Относительные   годовые   за-	20 ч	29 сут
затраты: фермент носитель	1000	37 1040 1580 185 5,6
реагенты реактор     (без   фер- фермента) Стоимость  пропродукта   за   1   т	300 26

ропов из кукурузного  крахмала с помощью иммобилизованной глюкозоизомеразы в полтора раза более экономично, чем получение сахара из сахарной свеклы по обычной технологии (J. Hollo,1983).

Масштабы производства.

 Для промышленного производства глюкозо-фруктозных сиропов с помощью иммобилизованной глюкозоизомеразы рекомендуют производительность 30—100 или 400 т (по разным данным) в сутки в пересчете на сухое вещество. В целом благодаря быстрому внедрению новой технологии с использованием иммобилизованной глюкозоизомеразы производство и применение глюкозо-фруктозных сиропов в развитых странах чрезвычайно быстро расширяется.

Ниже приведены данные по производству глюкозо-фруктозных сиропов (в тыс. т) в США и Японии (Н. Ichikawa, 1977; W. Carasik, J. О. Carroll, 1983; К. Okada, 1978):

Год             США          Япония           Год            США         Япония

1972               —                 —               1977             1135             216

1973              136                 30              1978             1585              —

1974              363                —               1980             2300             300

1975              645                 75              1983             3250              —

1976              908               130

Предполагается, что в  Японии в 1980 г. около 10% всего потребляемого  сахара заменено на глюкозо-фруктозную смесь. В США уже в 1978 г. потребление населением фруктозы (6 кг на человека в год) составило 12% от потребления и ожидается дальнейший рост вплоть до 30—40% к 2000 г. Значительные количества глюкозо-фруктозного сиропа производятся также в Канаде, Аргентине и других странах.

В странах Европейского экономического сообщества (страны Общего рынка), где глюкозо-фруктозный сироп  производится под

коммерческим названием  «изоглюкоза», существуют определенные политические ограничения на выпуск этого продукта, вызванные защитой интересов производителей сахарной свеклы. Производство глюкозо-фруктозных сиропов в Западной Европе в 1976 г. составляло немногим более 100 тыс. т (Англия — 35, Испания — 25, ФРГ — 21, Бельгия — 14, Нидерланды — 10 тыс. т), в 1980 г. — около 0,75—-1,0 млн. т. В это же время также были созданы предприятия по производству глюкозо-фруктозных сиропов во Франции, Ирландии, Италии, Югославии. В целом производство глюкозо-фруктозных сиропов в мире в 1980 г. составляло 3,7 млн. т (R. L. Artrim, 1979; J, Hollo, 1983).

 

 

 

 

 

 

 

2. Получение L-аминокислот

 

Аминокислоты — главный  строительный материал организма, из которого формируются пептиды и белки. Растения и микроорганизмы способны сами синтезировать все нужные им аминокислоты из более простых химических соединений. Однако человеческий организм способен синтезировать лишь 12 из 20 аминокислот, необходимых ему для жизнедеятельности. Остальные 8 аминокислот получили название незаменимых и должны поступать в организм извне—с пищей. При нехватке хотя бы одной из незаменимых аминокислот замедляется рост организма, проявляется патология. Поэтому важно синтезировать эти аминокислоты в промышленных масштабах для корректировки рационов питания, в лечебных и профилактических целях и т. д. Кроме того, аминокислоты (как заменимые, так и незаменимые) являются важнейшим сырьем для обеспечения многих биотехнологических процессов.

Производство многих аминокислот, в том числе и  незаменимых,—крупнотоннажная отрасль химической промышленности. Однако с помощью химических методов получается смесь оптических изомеров аминокислот, иначе говоря, смесь L- и D-амино-кислот, молекулы которых в L- и D-форме представляют собой зеркальные изомеры. В химических реакциях эти изомеры практически неразличимы, однако человеческий организм усваивает лишь L-аминокислоты (за исключением метионина). Для большинства биотехнологических процессов D-аминокислоты также не представляют ценности.

Разделение смеси L- и D-аминокислот, так называемой рацемической смеси, на составляющие их изомеры стало первым процессом в мире, осуществленным с помощью иммобилизованных ферментов на промышленном уровне. Этот процесс был реализован в Японии на предприятии, принадлежащем компании «Танабе Сейяку» в 1969 г. В течение 15 предшествующих лет данный процесс проводился с  применением  растворимого  фермента — аминоацилазы, но он был недостаточно экономичен (I. Chibata, 1976). После перехода на иммобилизованную аминоацилазу экономическая эффективность процесса возросла в полтора раза, и в настоящее время компания осуществляет на промышленном уровне производство пяти L-аминокислот, из них четыре незаменимые (метионин, валин, фенилаланин, триптофан).

В качестве исходного  вещества используются ацилированные D, L-аминокислоты, полученные с помощью обычного химического синтеза. Фермент аминоацилаза гидролизует один ацил-L-изомер, отщепляя от него объемную ацильную группу, и тем самым резко увеличивая растворимость образующейся L-аминокислоты по сравнению с присутствующим в реакционной системе ацил-Д-изомером. После этого вещества легко отделяются друг от друга путем известных физико-химических методов. Так выделяется чистая L-аминокислота.

Остающаяся ацил-Б-аминокислота при нагревании рацеми-зуется, т. е. переходит опять в смесь ацилированных D, L-аминокислот, и процесс повторяют сначала. Таким образом, в итоге единственным продуктом является L-аминокислота. Оказалось, что для аминоацилазы не имеет значения, какую аминокислоту ей гидролизовать, важно лишь строение ацильной части, к которой фермент имеет строгую специфичность. В результате этого одна и та же реакционная колонна с иммобилизованной амино-ацилазой может быть применена в производстве самых различных L-аминокислот.

Иммобилизованный фермент  легко готовить, так как он легко  адсорбируется на специальной смоле, которую затем помещают в реакционную колонну. Время полуинактивации иммобилизованного фермента в промышленных условиях составляет 65 сут. Когда активность катализатора падает ниже нормы, в колонну добавляют раствор свежего фермента (раз в несколько месяцев), который опять адсорбируется на носителе. Устойчивость полимерного носителя высокая; так, на предприятии японской компании «Танабе Сейяку» он используется более 8 лет в одной и той же колонне без замены (I. Chibata, 1978).

 

 

 

3. Получение L-аспарагиновой кислоты

 

Аспарагиновая кислота  не принадлежит к числу незаменимых, но производится в мире многими тысячами тонн. Она находит широкое применение в пищевой промышленности для  придания (в сочетании с другой аминокислотой -— глицином) кондитерским изделиям и напиткам различных оттенков кислого или сладкого вкуса. Аспарагиновую кислоту можно получать с помощью фермента аспартазы. В качестве исходных веществ для ферментативного синтеза используются фумаровая кислота и аммиак — крупнотоннажные продукты органического и неорганического синтеза.   Протекающая реакция одностадийна — в присутствии

фермента молекула аммиака  присоединяется к фумаровой кислоте по месту двойной связи с образованием оптически активной L-аспарагиновой кислоты. В этом процессе впервые в технологической практике были применены иммобилизованные клетки микроорганизма, содержащие фермент в его естественной микробной оболочке. Этот процесс был разработан японской фирмой «Танабе Сейяку» в 1973 г.  (I. Chibata, 1976).

Плотный гель с иммобилизованными  в нем микробными клетками, содержащими  аспартазу, формуют в кубики размерами 2—3 мм, набивают ими колонну объемом 1 м³ и пропускают через_ нее раствор фумарата аммония. На выходе из колонны L-аспарагиновую кислоту кристаллизуют, центрифугируют и промывают холодной водой. Процесс практически полностью автоматизирован и осуществляется в непрерывном режиме. Масштабы производства на фирме «Танабе Сейяку»—1700 кг чистой L-гспарагиновой кислоты в сутки на реактор объемом 1 м³ (I. Chibata, 1980).

 

 

 

 

 

4. Получение L-яблочной кислоты

 

Яблочная кислота находит  спрос в качестве заменителя лимонной кислоты в продуктах питания  и фармацевтических препаратах. Химическим путем (гидролизом ангидрида яблочной кислоты) производят только рацемическую смесь оптических изомеров яблочной кислоты, в то время как оптически активный L-изомер, получаемый микробиологическим способом, пока слишком дорог для промышленного производства.

L-яблочную кислоту получают ферментативным путем, так же как и L-аспарагиновую кислоту, из фумаровой кислоты. Здесь в качестве катализатора используют иммобилизованные в гель клетки, содержащие фермент фумаразу. В присутствии этого фермента происходит присоединение воды по двойной связи молекулы фумаровой кислоты. В остальном реакция протекает так, как и в случае L-аспарагиновой кислоты. В обычных (интакт-ных) клетках время полуинактивации фумаразы составляет 6 сут, в иммобилизованных в полиакриламидный гель — 55 сут, а в иммобилизованных в гель на основе каррагинана — полисахарида  из морских водорослей — 160 сут   (I.  Chibata,   1980).

 

5. Получение  безлактозного молока

 

Лактоза, или молочный сахар, содержится в достаточно больших количествах в молоке и молочной сыворотке. Этот сахар характеризуется малой сладостью и низкой растворимостью, в его присутствии происходит кристаллизация мороженого и других молочных изделий и продуктов, что является причиной неприятных вкусовых ощущений.

Молекулы лактозы распадаются  на глюкозу и галактозу при  гидролизе под действием лактазы, или р-галактозидазы. Молоко после такой обработки приобретает новые диетические качества, поскольку определенная часть населения не может употреблять молоко из-за наличия в нем лактозы. Это свойство организма получило название лактазной недостаточности.