Физико-химические свойства белков и методы их выделения

70

Рис. 1-55. Разделение смеси белков методом гель-фильтрации.

Рис. 1-56. Кювета, заполненная буферным раствором с разделёнными белковыми фракциями.

Электрофорез белков

Метод основан  на том, что при определённом значении рН и ионной силы раствора белки двигаются в электрическом поле со скоростью, пропорциональной их суммарному заряду. Белки, имеющие суммарный отрицательный заряд, двигаются к аноду (+), а положительно заряженные белки - к катоду (-).

Электрофорез проводят на различных носителях: бумаге, крахмальном геле, полиакриламидном геле и др. В отличие от электрофореза на бумаге, где скорость движения белков пропорциональна только их суммарному заряду, в полиакриламидном геле скорость движения белков пропорциональна их молекулярным массам.

Разрешающая способность  электрофореза в полиакриламидном геле выше, чем на бумаге. Так,

71

при электрофорезе  белков сыворотки крови человека на бумаге обнаруживают только 5 главных  фракций: альбумины, α₁ глобулины, α₂-глобулины, β-глобулины и γ-глобулины (рис. 1-57). Электрофорез тех же белков в полиакриламидном геле позволяет получить до 18 различных фракций. Для обнаружения белковых фракций полоски бумаги или столбики геля обрабатывают красителем (чаще всего бромфеноловым синим или амидовым чёрным). Окрашенный комплекс белков с красителем выявляет расположение различных фракций на носителе.

Ионообменная хроматография

Так же как и  электрофорез, метод основан на разделении белков, различающихся суммарным  зарядом при определённых значениях рН и ионной силы раствора. При пропускании раствора белков через хроматографическую колонку, заполненную твёрдым пористым заряженным материалом, часть белков задерживается на нём в результате электростатических взаимодействий.

В качестве неподвижной фазы используют ионообменники - полимерные органические вещества, содержащие заряженные функциональные группы.

Различают положительно заряженные анионообменники, среди  которых наиболее часто используют диэтиламиноэтилцеллюлозу (ДЭАЭ-целлюлозу), содержащую катионные группы, и отрицательно заряженные катионообменники, например карбоксиметилцеллюлозу (КМ-цел-люлозу), содержащую анионные группы.

Выбор ионообменника  определяется зарядом выделяемого  белка. Так, для выделения отрицательно

Рис. 1-57. Электрофорез белков сыворотки крови здорового человека на бумаге.

заряженного белка  используют анионообменник. При пропускании  раствора белка через колонку  прочность связывания белка с  анионообменником зависит от количества отрицательно заряженных карбоксильных  групп в молекуле. Белки, адсорбированные на анионообменнике, можно смыть (элюировать) буферными растворами с различной концентрацией соли, чаще всего NaCI, и разными значениями рН. Ионы хлора связываются с положительно заряженными функциональными группами анионообменника и вытесняют карбоксильные группы белков. При низких концентрациях соли элюируются белки, слабо связанные с анионообменником. Постепенное увеличение концентрации соли или изменение рН, что меняет заряд белковой молекулы, приводит к выделению белковых фракций, в одной из которых находится искомый белок.

Аффинная хроматография, или хроматография по сродству

Это наиболее специфичный  метод выделения индивидуальных белков, основанный на избирательном  взаимодействии белков с лигандами, прикреплёнными (иммобилизированными) к твёрдому носителю. В качестве лиганда может быть использован субстрат или кофермент, если выделяют какой-либо фермент, антигены для выделения антител и т.д. Через колонку, заполненную иммобилизованным лигандом, пропускают раствор, содержащий смесь белков. К ли-ганду присоединяется только белок, специфично взаимодействующий с ним; все остальные белки выходят с элюатом (рис. 1-58). Белок, адсорбированный на колонке, можно снять, промыв её раствором с изменённым значением рН или изменённой ионной силой. В некоторых случаях используют раствор детергента, разрывающий гидрофобные связи между белком и лигандом.

Аффинная хроматография  отличается высокой избирательностью и помогает очистить выделяемый белок  в тысячи раз.

3. Очистка белков от низкомолекулярных 
примесей

Для удаления низкомолекулярных  соединений, в частности сульфата аммония после высаливания, применяют  диализ. Метод основан на том, что  через полупроницаемую мембрану,

72

Рис. 1-58. Аффинная хроматография.

пропускающую  низкомолекулярные вещества, не проходят белки, имеющие более высокую  молекулярную массу. В стакан большой  ёмкости (около 1 л) с буферным раствором  помещают полупроницаемый мешочек, заполненный раствором белка с солью.

Скорость выхода соли из мешочка в буферный раствор  пропорциональна градиенту его  концентраций по обе стороны от мембраны. По мере выхода соли из мешочка буферный раствор в стакане меняют.

Для очистки  белков от низкомолекулярных примесей используют также метод гель-фильтрации (см. выше).

Для определения  частоты (гомогенности) выделенного  белка применяют методы с высокой  разрешающей способностью, например электрофорез в полиакриламидном геле, высокоэффективная хроматография высокого давления. От чистоты лекарственного белкового препарата зависят его биологическая эффективность и аллергенность (т.е. способность вызывать аллергические реакции). Чем качественнее очищен препарат, тем меньше вероятность осложнений при его применении.

73 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

Белки8

В настоящее  время установлено, что в живой природе не существует небелковых организмов.

Белки – это  высокомолекулярные полимерные соединения, образующие при гидролизе аминокислоты. В организме животных белков содержится до 40-50 % и более на сухую массу, у растений до 20-35%.Разнообразны и очень важны функции белков.

Строительная, структурная  функция. Белки образуют основу протоплазмы  любой живой клетки, в комплексе  с липидами они являются основным структурным материалом всех клеточных  мембран, всех органелл.

Каталитическая  функция. Практически все биохимические реакции катализируются белками-ферментами.

Двигательная  функция. Любые формы движения в  живой природе (работа мышц, движение ресничек и жгутиков у простейших) осуществляются белковыми структурами  клеток.

Транспортная  функция. Белок крови гемоглобин транспортирует кислород от легких к тканям и органам. Есть белки крови, транспортирующие липиды, железо, стероидные гормоны. Перенос многих веществ через клеточные мембраны осуществляют особые белки-переносчики.

Защитная функция. Важнейшие факторы иммунитета – антитела и система комплемента являются белками. Процесс свертывания крови, защищающий организм от чрезмерной кровопотери происходит с участием белков фибриногена, тромбина и других факторов свертывания, тоже являющихся белками. Внутренние стенки пищевода, желудка выстланы защитным слоем слизистых белков – муцинов. Основу кожи, предохраняющей тело от многих внешних воздействий, составляет белок коллаген.

Гормональная  функция. Ряд гормонов по своему строению относится к белкам (инсулин) или пептидам (АКТГ, окситоцин, вазопрессин).

Опорная функция. Сухожилия, суставные сочленения, кости  скелета образованы в значительной степени белками.

Запасная функция. Белки способны образовывать запасные отложения (овальбумин яиц, казеин молока, многие белки семян).

Белки имеют  большое народнохозяйственное значение. Белки являются основными компонентами пищи человека и животных. Многие заболевания  связаны с хроническим белковым голоданием. Технология многих производств  основана на переработке белков, Изменении их свойств.

Структурными  элементами белков являются аминокислоты.

Аминокислоты  можно рассматривать как производные  карбоновых кислот, в которых один из водородов углеродной цепи замещен  на группу NH2.

Строение белковой молекулы. Аминокислоты соединяются друг с другом ковалентной пептидной или амидной связью. Образование ее происходит за счет аминогруппы (NH2)одной аминокислоты и карбоксильной (СООН) группы другой с выделением молекулы воды.

Структура молекулы белка имеет четыре уровня. Первичная структура белковой молекулы это порядок чередования аминокислот в полипептидной цепи. Вторичная структура – это упорядоченное пространственное расположение отдельных участков полипептидной цепи, она образуется за счет замыкания водородных связей между пептидными группами. Третичная структура описывает пространственную укладку всей молекулы белка. В поддержании третичной структуры белка, ее закреплении принимают участие различные типы связей (ковалентные, ионные, водородные и гидрофобные взаимодействия). Под четвертичной структурой понимают способ взаимного расположения в пространстве отдельных полипептидных цепей в молекуле, характер связей между ними.

Все белки принято  делить на две группы: простые, или  протеины (состоят только из аминокислот), и сложные (в их молекуле помимо белковой части содержится и небелковая, простетическая): хромопротеины, липопротеины, нуклеопротеины и т. д.

Ферменты9

Ферменты, или  энзимы, - это катализаторы белковой природы, образующиеся и функционирующие во всех живых организмах.

Являясь катализаторами – веществами, ускоряющими реакции, ферменты имеют ряд общих свойств  с химическими, небиологическими катализаторами.

Ферменты не входят в состав конечных продуктов реакции и выходят из реакции в первоначальном виде. Они не расходуются в процессе катализа.

Ферменты не могут возбудить реакций, противоречащих законам термодинамики, они только ускоряют те реакции, которые могут  протекать и без них.

Ферменты, как правило, не смещают положения равновесия реакции, а лишь ускоряют его достижение.

Для ферментов  характерны и специфические свойства, отличающие их от химических катализаторов, выражающих их химическую природу.

По химическому  строению молекулы все ферменты являются белками.

Эффективность ферментов выше, чем небиологических  катализаторов.

Ферменты обладают узкой специфичностью, избирательностью действия на субстраты, т.е. на вещества, превращения, которых они катализируют.

Одним из важнейших  свойств ферментов является их регулируемость.

При ферментативных реакциях в отличие от неферментативных наблюдаются лишь незначительные побочные процессы, для ферментативных реакций  характерен почти 100% выход продуктов.

Согласно классификации, все ферменты разделяются на шесть классов в соответствии с характером катализируемых ими реакций.

Оксидоредуктазы. Катализируют окислительно-восстановительные  реакции.

Трансферазы. Катализируют реакции переноса группировок с  одного соединения на другое.

Гидролазы. Ускоряют гидролитическое расщепление веществ.

Лиазы. Катализируют реакции негидролитического расщепления  с образованием двойных связей или  реакции присоединения по двойным  связям.

Изомеразы. Катализируют реакции изомерации соединений.

Лигазы (синтетазы). Ускоряют реакции синтеза с использованием энергии макроэргических соединений.

Ферментативные  препараты находят широкое применение в различных отраслях промышленности. В хлебопекарном производстве для  ускорения гидролиза крахмала и  улучшения качества теста используют амилазы. При приготовлении детской пищи с целью облегчения переваривания углеводов и белков исходные продукты обрабатываются амилазой и протеиназами. Специфические протеиназы используют в виноделии, в кожевенной промышленности, при производстве синтетических моющих средств. Ферменты используют как лекарственные средства: пепсин, трипсин, химотрипсин, лидаза, стрептокиназа…