Микроскопия. Методы микроскопии

Микроскопия. Методы микроскопии

Микроскопия (лат. μΙκροσ — мелкий, маленький и σκοποσ — вижу) — изучение объектов с использованием микроскопа. Подразделяется на несколько видов: оптическая микроскопия, электронная микроскопия, рентгеновская или рентгеновская лазерная микроскопия, отличающиеся использованием электромагнитных лучей с возможностью рассмотрения и получения изображений микроэлементов вещества в зависимости от разрешающей способности приборов (микроскопов).

Оптическая микроскопия. Человеческий глаз представляет собой естественную оптическую систему, характеризующуюся определённым разрешением, т. е. наименьшим расстоянием между элементами наблюдаемого объекта (воспринимаемыми как точки или линии), при котором они ещё могут быть отличены один от другого. Для нормального глаза при удалении от объекта на т. н. расстояние наилучшего видения (D = 250 мм), среднестатистическое нормальное разрешения составляет 0,176 мм. Размеры микроорганизмов, большинства растительных и животных клеток, мелких кристаллов, деталей микроструктуры металлов и сплавов и т. п. значительно меньше этой величины. Для наблюдения и изучения подобных объектов и предназначены микроскопы различных типов. С помощью микроскопов определяют форму, размеры, строение и многие другие характеристики микрообъектов.

Оптический, или световой микроскоп использует видимый свет, проходящий через прозрачные объекты, или отражённый от непрозрачных. Оптическая система из нескольких линз позволяет получить кажущееся увеличенное изображение образца. Полученное изображение можно наблюдать глазом (или обеими глазами, в бинокуляре), либо фотографировать, передавать на видеокамеру для оцифровки. В состав современного микроскопа обычно входит система подсветки, столик для перемещения объекта (препарата), наборы специальных объективов и окуляров.

Микроскоп – оптический прибор имеющий оптическую систему линз с двумя ступенями увеличения угла зрения и рассматриваемых объектов. Первая осуществляется объективом, вторая окуляром.

Были разработаны виды микроскопов, позволяющие существенно расширить возможности обычной оптической микроскопии:

• Люминесцентный микроскоп
• Поляризационный микроскоп
• Металлографический микроскоп

Люминесцентный  микроскоп

Для проведения люминесцентной микроскопии используются либо специальные  люминесцентные микроскопы, либо приставки  к обычным биологическим микроскопам, позволяющие использовать их для  наблюдения люминесценции микрообъектов.

Люминесцентный  микроскоп снабжен мощным источником освещения с большой поверхностной  яркостью, максимум излучения которого находится в коротковолновой  области видимого спектра, системой светофильтров, а также интерференционной  светоделительной пластинкой, применяемой  при возбуждении люминесценции  падающим светом. Эта система возбуждения  люминесценции падающим светом через  опак – иллюминатор имеет ряд  преимуществ:

1. интерференционная светоделительная пластинка с нанесёнными на неё слоями диэлектриков избирательно отражает на препарат более 90% света, возбуждающего люминесценцию, и почти полностью пропускает более длинноволновый свет люминесценции, что позволяет увеличить яркость люминесценции;
2. объектив микроскопа служит одновременно конденсором осветительной системы; поэтому при использовании высокоапертурных иммерсионных объективов с большим увеличением освещённость препарата и соответственно яркость люминесценции возрастают пропорционально четвёртой степени апертуры объектива;
3. люминесцентную микроскопию можно сочетать с фазово-контрастной и интерференционной при освещении снизу через конденсор микроскопа.

Источниками освещения  для люминесцентного микроскопа чаще являются ртутно-кварцевые лампы  сверхвысокого давления, а также  лампы накаливания: ксеноновые и  кварцево-галогенные.

Светлопольный метод дает хорошие результаты для окрашенных и контрастных объектов. Но для увеличения контрастности изучаемых объектов необходимо сильно закрывать диафрагму конденсора, что приводит к уменьшению разрешающей способности микроскопа.

Увеличение контрастности  в темном поле тоже имеет свои недостатки. При темнопольном методе исследования наблюдается картина противоположная  контрастному изображению в светлом  поле. Темные места в темном поле будут светлыми, а светлые - темными. Кроме того, темнопольная микроскопия позволяет увидеть только контуры микрообъекта, но не дает возможности изучить внутреннюю структуру клетки или микроорганизма.

Перечисленные недостатки исключает метод фазово-контрастной  микроскопии. Основное достоинство  данного метода заключается в  том, что при его помощи получают чрезвычайно контрастные изображения  в светлом поле живых неокрашенных клеток и тканей.

Впервые фазово-контрастный  микроскоп был разработан в начале ХХ века Фрицем Цернике. Ученый разработал систему колец, которые были расположены в линзах объектива и конденсора. Новый ультрамикроскопический метод стал востребованным лишь после окончания войны и оказался настолько продуктивным и прогрессивным, что первооткрывателю, в 1953 году, была присуждена Нобелевская премия по физике.

Сущность фазово-контрастного метода заключается в преобразовании фазовых смещений светловых волн, которые образуются при прохождении через полупрозрачные элементы препарата в колебания с иной амплитудой.

Практическое осуществление  метода фазового контраста достигается  следующим образом. В передней фокальной  плоскости конденсора вместо ирисовой диафрагмы установлена кольцеобразная диафрагма, которая изображается в  выходном зрачке объектива вблизи заднего  фокуса. Фазовая пластинка с фазовым  кольцом помещается в плоскости  зрачка выхода объектива. Размеры кольца равны размерам изображения кольцевой  диафрагмы конденсора. Фазовое кольцо поглощает значительную часть прямо  прошедшего света и сдвигает амплитуду  световых колебаний.

Фазовое кольцо представляет собой вытравленную канавку. Таким  образом, лучи, не отклоненные объективом, проходят в пластине несколько меньший  слой стекла, чем диафрагмированные  лучи и фаза прямо прошедшего света  опережает фазу диафрагмированного. Элементы препарата с большим  коэффициентом преломления становятся более темными. Описанная выше методика носит название «позитивный фазовый  контраст».

Если фазовое  кольцо представляет собою тонкую кольцеобразную пленку из прозрачного вещества, то прямые лучи проходят с некоторым  запаздыванием и элементы препарата  с большим коэффициентом преломления  выглядят более светлыми. Данная методика получила название «негативный фазовый  контраст»

В основном фазово - контрастный микроскоп применяется в микробиологических и цитологических исследованиях - изучении различных видов живых микроорганизмов на различных стадиях жизненного цикла, в исследованиях структуры клеток (хромосомы, ядра, аппарат Гольджи) и при анализе изменений, вызванных различными химическими агентами.

Широко используется фазово-контрастный микроскоп в клинических лабораториях при изучении осадков мочи, вагинальных выделений, эякулята, для счета и изучения рекулоцитов и кровяных пластинок, для исследования простейших и их цист, живых бактерий, процессов агглютинации, вирусов и вирусных телец, кроме того при исследовании материала биопсий.

Ведущие компании по разработке и производству микрооптических систем комплектуют биологические микроскопы оборудованием для проведения фазово - контрастной микроскопии. Компания «Micros» предлагает подобный набор для микроскопов МС 100, МС 300 и MC 300X ERGO.

До 1950-х годов работали преимущественно в диапазоне  видимого спектра света. Глаз работает в оптическом диапазоне длин волн. Оптические микроскопы не могли давать разрешающей способности менее  полупериода волны опорного излучения (для видимого диапазона длина  волн 0,2—0,7 мкм, или 200—700 нм). Предельное увеличение оптического микроскопа — до 2000 раз. Дальнейшее увеличение изображения нецелесообразно, так как не позволяло обнаружить дополнительных деталей структуры вещества. Отдельные частички размером приблизительно до 0,15 мкм хорошо видны при увеличении в 2000 раз. Более мелкие частицы не отражают световые лучи и не видны под микроскопом.

Люминесцентная микроскопия, метод наблюдения под микроскопом люминесцентного свечения микрообъектов при освещении их сине-фиолетовым светом или ультрафиолетовыми лучами.

Примером такого свечения являются известные всем лампы  дневного света, в которых в результате облучения ультрафиолетовыми лучами светится специальный состав - люминофор, покрывающий изнутри колбу лампы.

Цвет люминесценции  обычно смещен в более длинноволновую часть спектра по сравнению с возбуждающим ее светом. Так, если люминесценция возбуждается синим светом, то цвет ее может быть от зеленого до красного, если люминесценция возбуждается невидимым ультрафиолетовым излучением, то цвет ее может быть в любой части видимого спектра. Эта особенность люминесценции позволяет, используя специальные светофильтры, поглощающие возбуждающий свет, наблюдать сравнительно слабое люминесцентное свечение.

Для изучения микроорганизмов  в люминесцентном микроскопе их предварительно окрашивают (флюорохромируют) сильно разведенными растворами специальных люминесцирующих красителей (флюорохромов), которые избирательно связываются с определенными структурами клетки. Флюорохромы отличаются от обычных красителей тем, что применяются в очень малых концентрациях (до нескольких мкг/мл); кроме того, ими могут быть окрашены не только фиксированные, но и живые клетки. Люминесцентная микроскопия также используется для регистрации результатов реакции иммунофлюоресценции (РИФ)).