Методы изучения вирусов

     Введение

     Человек использовал бактерии, ещё не зная об их существовании. С помощью заквасок, содержащих Бактерии, приготовляли кисломолочные  продукты, уксус, тесто и т.д. Впервые бактерии увидел А. Левенгук — создатель микроскопа, исследуя растительные настои и зубной налёт. К концу 19 — началу 20 вв. было выделено большое число бактерий, обитающих в почве, воде, пищевых продуктах и т.п., были открыты многие виды болезнетворных бактерий. Классические исследования Л. Пастера в области физиологии бактерии послужили основой для изучения у них обмена веществ. Вклад в исследование бактерии внесли русские и советские учёные С.Н. Виноградский, В.Л. Омелянский, Л. Исаченко, выяснившие роль бактерии в круговороте веществ в природе, который делает возможной жизнь на Земле. Это направление в микробиологии неразрывно связано с развитием геологии, биогеохимии, почвоведения, с учением В.И. Вернадского о биосфере.  
Физиология микроорганизмов изучает жизнедеятельность микробных клеток, процессы их питания, дыхания, роста, размножения, закономерности взаимодействия с окружающей средой.  
Выяснение физиологии этих микроорганизмов важно для постановки микробиологического диагноза, проведения лечения и профилактики инфекционных заболеваний, регуляции взаимоотношений животного организма с окружающей средой.  
Генетика (от греческого genesis - происхождение) - наука о наследственности и изменчивости организмов. Начало генетики как науки положил Мендель, который, скрещивая между собой сорта гороха с качественно различающимися признаками, установил главные закономерности наследственности. Изучение и анализ законов передачи наследственных признаков от поколения к поколению, а также выяснение механизмов, обеспечивающих наследования на всех уровнях организации живых существ, является главной целью генетики. Успехи генетики стали возможны благодаря совместной работе микробиологов, генетиков, химиков и физиков, которые в своих исследованиях использовали микроорганизмы. Именно бактерии и вирусы оказались наиболее простой и удобной моделью для решения насущных проблем молекулярной генетики.  

     Химический  состав

     По  химическому составу бактерии не отличаются от клеток других организмов. Бактериальная клетка содержит 80% воды и 20% сухого остатка. Около 90% сухого остатка бактерии составляют высокомолекулярные соединения: нуклеиновые кислоты (10%), белки (40%), полисахариды (15%}, пептидогликон (10%) и липиды (15%); остальные 10% приходятся на моносахара, аминокислоты, азотистые основания, неорганические соли и другие низкомолекулярные соединения. Вода - основной компонент бактериальной клетки. Она находится в свободном или связанном состоянии со структурными элементами клетки. В спорах количество воды уменьшается до 18—20%. Вода является растворителем для многих веществ, а также выполняет механическую роль в обеспечении тургора. При плазмолизе — потере клеткой воды в гипертоническом растворе — происходит отслоение протоплазмы от клеточной оболочки. Удаление воды из клетки, высушивание приостанавливают процессы метаболизма. Большинство микроорганизмов хорошо переносят высушивание. При недостатке воды микроорганизмы не размножаются. Высушивание в вакууме из замороженного состояния (лиофилязация) прекращает размножение и способствует длительному сохранению микробных особей.  
Белки (40—80% сухой массы) определяют важнейшие биологические свойства бактерий и состоят обычно из сочетаний 20 аминокислот. В состав бактерий входит диаминопимелиновая кислота, отсутствующая в клетках человека и животных. Бактерии содержат более 2000 различных белков, находящихся в структурных компонентах и участвующих в процессах метаболизма. Большая часть белков обладает ферментативной активностью. Белки бактериальной клетки обусловливают антигенность и иммуногенность, вирулентность, видовую принадлежность бактерий.  
Нуклеиновые кислоты бактерий выполняют функции, аналогичные нуклеиновым кислотам эукариотических клеток: молекула ДНК в виде хромосомы отвечает за наследственность, рибонуклеиновые кислоты (информационная, или матричная, транспортная и рибосомная) участвуют в биосинтезе белка.  
Углеводы бактерий представлены простыми веществами (моно- и дисахариды) и комплексными соединениями. Полисахариды часто входят в состав капсул. Некоторые внутриклеточные полисахариды (крахмал, гликоген и др.) являются запасными питательными веществами.  
Липиды в основном входят в состав цитоплазматической мембраны и ее производных, а также клеточной стенки бактерий, например наружной мембраны, где, кроме биомолекулярного слоя липидов, имеется ЛПС. Липиды могут выполнять в цитоплазме роль запасных питательных веществ. Липиды бактерий представлены фосфолипидами, жирными кислотами и глицеридами. Наибольшее количество липидов (до 40 %) содержат мвкобактерии туберкулеза.  
Минеральные вещества бактерий обнаруживают в золе после сжигания клеток. В большом количестве выявляются фосфор, калий, натрий, сера, железо, кальций, магний, а также микроэлементы (цинк, медь, кобальт, барий, марганец и др.). Они участвуют в регуляции осмотического давления, рН среды, окислительно-восстановительного потенциала, активируют ферменты, входят в состав ферментов, витаминов и структурных компонентов микробной клетки.  

Питание, дыхание и размножение  бактерий  
Питание бактерий

     Особенности питания бактериальной клетки состоят  в поступлении питательных субстратов внутрь через всю ее поверхность, а также в высокой скорости процессов метаболизма и адаптации  к меняющимся условиям окружающей среды. 

     Типы  питания. Широкому распространению бактерий способствует разнообразие типов питания. Микроорганизмы нуждаются в углеводе, азоте, сере, фосфоре, калии и других элементах. В зависимости от источников углерода для питания, бактерии делятся на аутотрофы (от греч. autos - сам, trophe - пища), использующие для построения своих клеток диоксид углерода С02 и другие неорганические соединения, и гетеротрофы (от греч. heteros -другой, trophe - пища), питающиеся за счет готовых органических соединений. Аутотрофными бактериями являются нитрифицирующие бактерии, находящиеся в почве; серобактерии, обитающие в воде с сероводородом; железобактерии, живущие в воде с закисным железом, и др.  
Гетеротрофы, утилизирующие органические остатки отмерших организмов в окружающей среде, называются сапрофитами. Гетеротрофы, вызывающие заболевания у человека или животных, относят к патогенным и условно-патогенным. Среди патогенных микроорганизмов встречаются облигатные и факультативные паразиты (от греч. parasitos — нахлебник). Облигатные паразиты способны существовать только внутри клетки. например риккетсии, вирусы и некоторые простейшие. В зависимости от окисляемого субстрата, называемого донором электронов или водорода, микроорганизмы делят на две группы. Микроорганизмы, не пользующие в качестве доноров водорода неорганические соединения, называют лйтотрофнымн (от греч. lithos — камень), а микроорганизмы, использующие в качестве доноров водорода органические соединения — органотрофами. Учитывая источник энергии, среди бактерий различают фототрофы, т. е. фотосинтезирующие (например, сине-зеленые водоросли, использующие энергию света), и хемстрофы, нуждающиеся в химических источниках энергии. 

     Механизмы питания. Поступление различных веществ в бактериальную клетку зависит от величины и растворимости их молекул в липидах или воде, рН среды, концентрации веществ, различных факторов проницаемости мембран и др. Клеточная стенка пропускает небольшие молекулы и ионы, задерживая макромолекулы массой более 600 Д. Основным регулятором поступления веществ в клетку является цитоплазматическая мембрана. Условно можно выделить четыре механизма проникновения питательных веществ в бактериальную клетку: это простая диффузия, облегченная диффузия, активный транспорт, транслокация групп.  
Наиболее простой механизм поступления веществ в клетку - простая диффузия, при которой перемещение веществ происходит вследствие разницы их концентрации по обе стороны цитоплазматической мембраны. Вещества проходят через липидную часть цитоплазматической мембраны (органические молекулы, лекарственные препараты) и реже по заполненным водой каналам в цитоплазматической мембране. Пассивная диффузия осуществляется без затраты энергии.  
Облегченная диффузия происходит также в результате разницы концентрации веществ по обе стороны цитоплазматической мембраны. Однако этот процесс осуществляется с помощью молекул-переносчиков, локализующихся в цитоплазматической мембране и обладающих специфичностью. Каждый переносчик транспортирует через мембрану соответствующее вещество или передает другому компоненту цитоплазматической мембраны - собственно переносчику. Белками-переносчиками могут быть пермеазы, место синтеза которых -цитоплазматическая мембрана.  
Облегченная диффузия протекает без затраты энергии, вещества перемещаются от более высокой концентрации к более низкой.  
Активный транспорт происходит с помощью пермеаз и направлен на перенос веществ от меньшей концентрации в сторону большей, т.е. как бы против течения, поэтому данный процесс сопровождается затратой метаболической энергии (АТФ), образующейся в результате окислительно-восстановительных реакций в клетке.  
Перенос (транслокация) групп сходен с активным транспортом, отличаясь тем, что переносимая молекула видоизменяется в процессе переноса, например фосфорилируется.  
Выход веществ из клетки осуществляется за счет диффузии и при участии транспортных систем. 

     Ферменты  бактерий. Ферменты распознают соответствующие им метаболиты (субстраты Х вступают с ними во взаимодействие и ускоряют химические реакции. Ферменты являются белками, участвуют в процессах анаболизма (синтеза) и катаболизма (распада), т.е. метаболизма. Многие ферменты взаимосвязаны со структурами микробной клетки. Например, в цитоплазматической мембране имеются окислительно-восстановительные ферменты, участвующие в дыхании и делении клетки: ферменты, обеспечивающие питание клетки, и др. Окислительно-восстановительные ферменты цитоплазматической мембраны и ее производных обеспечивают энергией интенсивные процессы биосинтеза различных структур, в том числе клеточной стенки. Ферменты, связанные с делением и аутолизом клетки, обнаруживаются в клеточной стенке. Так называемые эндоферменты катализируют метаболизм, проходящий внутри клетки. Экзоферменты выделяются клеткой в окружающую среду, расщепляя макромолекулы питательных субстратов до простых соединений, усваиваемых клеткой в качестве источников энергии, углерода и др. Некоторые экзоферменты (пенициллиназа и др.) инактивируют антибиотики, выполняя защитную функцию.  
Различают конститутивные и индуцибельные ферменты. К констиутивным ферментам относят ферменты, которые синтезируются клеткой непрерывно, вне зависимости от наличия субстратов в питательной среде. Индуцибельные (адаптивные) ферменты синтезируются бактериальной клеткой только при наличии в среде субстрата данного фермента.  
Ферменты микроорганизмов используют в генетической инженерии (рестриктазы, лигазы и др.) для получения биологически активных соединений, уксусной, молочной, лимонной и других кислот, молочнокислых продуктов, в виноделии и других отраслях. Ферменты применяют в качестве биодобавок в стиральные порошки для уничтожения загрязнений белковой природы.  

Дыхание бактерий

     Дыхание, или биологическое окисление, основано на окислительно-восстановительных  реакциях, идущих с образованием АТФ- универсального аккумулятора химической энергии. Энергия необходима микробной клетке для ее жизнедеятельности. При дыхании происходят процессы окисления и восстановления: окисление — отдача донорами (молекулами или атомами) водорода или электронов; восстановление — присоединение водорода или электронов к акцептору. Акцептором водорода или электронов может быть молекулярный кислород (такое дыхание называется аэробным) или нитрат, сульфат, фумарат (такое дыхание называется анаэробным — нитратным, сульфатным, фумаратным). Анаэробиоз (от греч. аег — воздух + bios — жизнь) — жизнедеятельность, протекающая при отсутствии свободного кислорода. Если донорами и акцепторами водорода являются органические соединения, то такой процесс называется брожением. При брожении происходит ферментативное расщепление органических соединений, преимущественно углеводов, в анаэробных условиях. С учетом конечного продукта расщепления углеводов различают спиртовое, молочнокислое, уксуснокислое и другие виды брожения.  
По отношению к молекулярному кислороду бактерии можно разделить на три основные группы: облигатные, т.е. обязательные, аэробы, облигатные анаэробы и факультативные анаэробы. Облигатные аэробы могут расти только при наличии кислорода. Облигатные анаэробы (клостридии ботулизма, газовой гангрены, столбняка, бактероиды и др.) растут только на среде без кислорода, который для них токсичен. При наличии кислорода бактерии образуют перекисные радикалы кислорода, в том числе перекись водорода и супероксид-анион кислорода, токсичные для облигатных анаэробных бактерий, поскольку они не образуют соответствующие инактивирующие ферменты. Аэробные бактерии инактивируют перекись водорода и супероксидантом соответствующими ферментами (каталазой, пероксидазой и супероксиддисмутазой). Факультативные анаэробы могут расти как при наличии, так и при отсутствии кислорода, поскольку они способны переключаться с дыхания в присутствии молекулярного кислорода на брожение в его отсутствие. Факультативные анаэробы способны осуществлять анаэробное дыхание, называемое нитратным: нитрат, являющийся акцептором водорода, восстанавливается до молекулярного азота и аммиака.  
Среди облигатных анаэробов различают аэротолерантные бактерии, которые сохраняются при наличии молекулярного кислорода, но не используют его.  
Для выращивания анаэробов в бактериологических лабораториях применяют анаэростаты — специальные емкости, в которых воздух заменяется смесью газов, не содержащих кислорода. Воздух можно удалять из питательных сред путем кипячения, с помощью химических адсорбентов кислорода, помещаемых в анаэростаты или другие емкости с посевами.  

Размножение бактерий

     Жизнедеятельность бактерий характеризуется ростом и  размножением. Под ростом часто понимают также увеличение числа особей в  единице объема среды, что, однако, правильнее отнести к размножению бактерий в популяции. Рост можно регистрировать визуально под микроскопом, на экране, на серийных фотоснимках и в окрашенных препаратах.Темп и характер роста у бактерий разной формы отличаются. У палочковидных бактерий стенка и масса растут равномерно, у шаровидных бактерий — неравномерно: масса пропорционально кубу, а стенка — пропорционально квадрату радиуса клетки. Поэтому кокки вначале растут быстро, а затем увеличение их массы сдерживается отставанием роста стенки.  
Размножение — самовоспроизведение, приводящее к увеличению количества бактериальных клеток в популяции. Бактерии размножаются путем бинарного деления пополам, реже путем почкования. Делению клеток предшествует репликация бактериальной хромосомы по полуконсервативному типу (двуспиральная цепь ДНК раскрывается и каждая нить достраивается комплементарной нитью), приводящая к удвоению молекул ДНК бактериального ядра — нуклеоида. Репликация хромосомной ДНК осуществляется от начальной точки. Хромосома бактериальной клетки связана в области оп с цитоплазматической мембраной. Репликация ДНК катализируется ДНК-полимеразами. Сначала происходит раскручивание (деспирализация) двойной цели ДНК, в результате чего образуется репликативная вилка (разветвленные цепи); одна из цепей, достраиваясь, связывает нуклеотиды от 5'- к 3' - концу, другая — достраивается посегментно.  
Репликация ДНК происходит в три этапа: инициация, элонгация, или рост цепи, и терминация. Образовавшиеся в результате репликации две хромосомы расходятся, чему способствует увеличение размеров растущей клетки: прикрепленные к цитоплазматичеекой мембране или ее производным (например, мезосомам) хромосомы по мере увеличения объема клетки удаляются друг от друга. Окончательное их обособление завершается образованием перетяжки или перегородки деления. Клетки с перегородкой деления расходятся в результате действия аутолитических ферментов, разрушающих сердцевину перегородки деления. Аутолиз при этом может проходить неравномерно: делящиеся клетки в одном участке остаются связанными частью клеточной стенки в области перегородки деления, такие клетки располагаются под углом друг к другу. 

Наследственность  и генетические рекомбинации у бактерий

     Преимущество  микроорганизмов над другими  организмами состоит, прежде всего, в высокой скорости размножения, гаплоидности и большой разрешающей  способности методов генетического  анализа этих организмов. Формирование на питательных средах многомиллиардных популяций бактерии в течение суток позволяет проводить быстрый и точный анализ происходящих в них количественных и качественных изменений. Сравнительная простота постановки эксперимента обусловливает эффективность селективного анализа микробной популяции и выделение единичных особей, мутировавших с частотой 10 и выше. Наконец, гаплоидность бактерий, имеющих в отличие от эукариотов одну хромосому, т.е. одну группу сцепления генов, обусловливает отсутствие у них явление доминантности, что способствует быстрому выявлению мутировавших генов.  
Материальной основой наследственности, определяющей генетические свойства всех организмов, в том числе бактерий и вирусов, является хромосома, представляющая собой огромную молекулу ДНК в виде двойной спирали, замкнутой в кольцо. Она и является носителем генетической информации. Вдоль хромосомы линейно располагаются генифунхционально неоднородные генетические детерминанты, т.е. фрагменты молекулы ДНК", контролирующие синтез одного белка или пептида. Совокупность генов, локализованных в гаплоидном (одинарном) наборе хромосом данного организма, называется геномом или генотипом. В более широком смысле генотип - совокупность всех наследственных факторов организма, как ядерных (геном), так и неядерных, вне хромосомных (пластидные и цитоплазматические) наследственных факторов. Генотип - носитель наследственной информации, передаваемой от поколения к поколению. Он представляет собой систему, контролирующую фенотип организма. Фенотипом является внешний вид организма со всеми внешними и внутренними признаками. Фенотип бактерий есть результат взаимодействия ее генотипа и среды. Появление в организме новых наследственно передаваемых свойств может быт вызвано разными типами изменений в генетическом аппарате. Источником последовательной изменчивости могут быть мутации генов. Под мутацией понимают внезапные естественные (спонтанные) или вызванные искусственно (индуцированные) стойкие изменения наследственных структур (генов, хромосом), а также обусловленные ими различные изменения свойств и признаков организма. При этом в двойной спирали ДНК могут происходить следующие изменения:  
- замещение пары оснований, имевшихся в исходной молекуле ДНК другой парой;  
- выпадение пары оснований из молекулы ДНК;  
- внедрение новой пары оснований в молекулу ДНК;  
- инверсия - поворот нескольких пар оснований на 180 ° С. 

     Таким образом, в основе мутации лежат  молекулярные изменения в хромосоме. Мутации у бактерий выявляются при  наследственных изменениях любого признака микроба. Классифицируют мутации по происхождению, локализации на хромосоме  клетки и другим признакам. Подобное деление носит условный характер. К спонтанным мутациям относят такие  мутации, причину возникновения  которых трудно и даже невозможно связать с действием определенного  фактора (мутагена). Они образуются самопроизвольно в любой популяции  микроорганизмов без видимого внешнего воздействия. Спонтанные мутанты образуются до воздействия селекционирующих факторов, которые лишь отбирают признаки, сформировавшиеся в популяции мутировавших бактериальных клеток. Так, например, антибиотикорезистентные клетки просуществуют в чувствительной бактериальной популяции, а не образуются в результате воздействия на нее соответствующего антибиотика. Последний только селекционирует резистентные особи, создавая условия для их размножения. Индуцирующие мутации возникают в результате обработки микроорганизмов мутагенными агентами (ультрафиолетовые и рентгеновые лучи, быстрые нейтроны и протоны, действие температуры, кислоты, щелочи, красители, соли металлов и др.)  
Разные мутагены отличаются по активности и механизму действия. Одни вызывают изменения числа и структуры хромосом, другие изменяют последовательность азотистых оснований в молекуле ДНК.  
Мутагены используются в селекции сельскохозяйственных растений и микроорганизмам с целью получения продуктивных и полезных форм.  
Микроорганизмам, как и высшим организмам, свойственны генетические рекомбинации.  
Рекомбинация - это перегруппировка генетического материала (ДНК) родительских генетических структур (хромосом, плазмид и др.), приводящая к появлению новых сочетаний генов у потомства. Основной механизм рекомбинации - кроссинговер- перекрест хромосом, при котором происходит разрыв участков двух генетических структур, их обмен и воссоединение. У микроорганизмов рекомбинация осуществляется в результате обмена участками двух молекул ДНК, либо их фрагментом. Генетические рекомбинации возникают в результате комплексных процессов, они могут захватывать большие участки хромосомы или происходить в пределах отдельных генов. Существуют специальные гены, детерминирующие рекомбинационную способность клеток - реципиентов.  
Передача генетического материала от одних бактерий к другим осуществляется путем трансформации, трансдукции и конъюгации.  
Трансформация бактерий - передача наследственных свойств от одних бактерий к другим при помощи экстрагированной ДНК, без прямого контакта клеток донора и реципиента и без участия бактериофага. Явление трансформации установлено у многих бактерий (пневмококки, анаэробы и др.). История открытия феномена трансформации связана с исследованием Ф. Гриффитса (1928 г.), который описал превращение бескапсульного авирулентного пневмококка в капсульный вирулентный вариант. В процессе трансформации различают пять стадий:  
1. Адсорбция трансформирующей ДНК на поверхности микробной клетки;  
2. Проникновение ДНК в клетку реципиента;  
3. Спаривание внедрившейся ДНК с хромосомными структурами клетки;  
4. Включение участка ДНК клетки - донора хромосомной структурой реципиента.  
5. Дальнейшее изменение нуклеоида в ходе последующих делений. Эффективность спаривания трансформирующих ДНК с гомологичным участком хромосомы реципиента зависит от гомологии ДНК донора и реципиента. Чем больше гомология, тем эффективнее спаривание, что определяет конечный результат трансформации, т.е. количество формирующихся рекомбинантов. Трансформировать могут признаки: устойчивость и чувствительность к антибиотикам, способность к синтезу ферментов и т.д. Как правило, при трансформации изменяется один какой-либо признак.