Физиология микроорганизмов

В процессе аэробного дыхания образуются токсические  продукты окисления (H₂O₂- перекись водорода, -О₂ – свободные кислородные радикалы), от которых защищают специфические ферменты, прежде всего каталаза, пероксидаза, пероксиддисмутаза. У анаэробов эти ферменты отсутствуют, также как и система регуляции окислительно- восстановительного потенциала (rH₂).

Основные  методы создания анаэробных условий для культивирования  микроорганизмов.

1.Физический- откачивание воздуха, введение  специальной газовой безкислородной  смеси (чаще-  N₂- 85%, CO₂- 10%, H₂- 5%).

2.Химический- применяют химические поглотители  кислорода.

3.Биологический-  совместное культивирование строгих  аэробов и анаэробов (аэробы  поглощают кислород и создают  условия для размножения анаэробов).

4.Смешанный-  используют несколько разных  подходов.

Необходимо  отметить, что создание оптимальных  условий для строгих анаэробов- очень сложная задача. Очень непросто обеспечить постоянное поддержание  безкислородных условий культивирования, необходимы специальные среды без  содержания растворенного кислорода, поддержание необходимого окислительно- восстановительного потенциала питательных  сред, взятие и доставка, посев материала  в анаэробных условиях.

Существует  ряд приемов, обеспечивающих более  подходящие условия для анаэробов- предварительное кипячение питательных  сред, посев в глубокий столбик  агара, заливка сред вазелиновым  маслом для сокращения доступа кислорода, использование герметически закрывающихся  флаконов и пробирок, шприцев и  лабораторной посуды с инертным газом, использование плотно закрывающихся  эксикаторов с горящей свечой. Используются специальные приборы  для создания анаэробных условий- анаэростаты. Однако в настоящее время наиболее простым и эффективным оборудованием  для создания анаэробных и микроаэрофильных условий является система “Газпак” со специальными газорегенерирующими  пакетами, действующими по принципу вытеснения атмосферного воздуха газовыми смесями  в герметически закрытых емкостях.

Основные  принципы культивирования  микроорганизмов  на питательных средах.

1.Использование  всех необходимых для соответствующих  микробов питательных компонентов.

2.Оптимальные  температура, рН, rH₂, концентрация ионов, степень насыщения кислородом, газовый состав и давление.

Микроорганизмы  культивируют на питательных средах при оптимальной температуре  в термостатах, обеспечивающих условия  инкубации.

По  температурному оптимуму роста выделяют три основные группы микроорганизмов.

1.Психрофилы- растут при температурах ниже +20 градусов Цельсия.

2.Мезофилы- растут в диапозоне температур  от 20 до 45 градусов (часто оптимум-  при 37 градусах С).

3.Термофилы-  растут при температурах выше  плюс 45 градусов.

Краткая характеристика питательных  сред.

По консистенции выделяют жидкие, плотные (1,5- 3% агара) и полужидкие (0,3- 0,7 % агара) среды.

Агар- полисахарид сложного состава из морских водорослей, основной отвердитель для плотных (твердых) сред. В качестве универсального источника углерода и азота применяют пептоны- продукты ферментации белков пепсином, различные гидролизаты- мясной, рыбный, казеиновый, дрожжевой и др.

По назначению среды разделяют на ряд групп:

- универсальные  (простые), пригодные для различных  нетребовательных микроорганизмов  (мясо- пептонный бульон- МПБ, мясо- пептонный агар- МПА);

- специальные-  среды для микроорганизмов, не  растущих на универсальных средах (среда Мак- Коя на туляремию,  среда Левенштейна- Иенсена для  возбудителя туберкулеза);

- дифференциально-  диагностические- для дифференциации  микроорганизмов по ферментативной  активности и культуральным свойствам  ( среды Эндо, Плоскирева, Левина, Гисса);

- селективные  (элективные)- для выделения определенных  видов микроорганизмов и подавления  роста сопутствующих- пептонная  вода, селенитовая среда, среда  Мюллера.

По происхождению среды делят на естественные, полусинтетические и синтетические.

Рост  и размножение  микроорганизмов.

Бактериальные клетки размножаются в результате деления. Основные стадии размножения микробов в жидкой среде в стационарных условиях:

- лаг-  фаза (начальная стадия адаптации  с медленным темпом прирости  биомассы бактерий);

- экспоненциальная (геометрического роста) фаза  с резким ростом численности  популяции микроорганизмов (2 в  степеии n);

- стационарная  фаза (фаза равновесия размножения  и гибели микробных клеток);

- стадия  гибели – уменьшение численности  популяции в связи с уменьшением  и отсутствием условий для  размножения микроорганизмов (дефицит  питательных веществ, изменение  рH, rH₂, концентрации ионов и других условий культивирования).

Данная  динамика характерна для периодических культур с постепенным истощением запаса питательных веществ и накоплением метаболитов.

Если  в питательной среде создают  условия для поддержания микробной  популяции в экспоненциальной фазе- это хемостатные (непрерывные) культуры.

Характер  роста бактерий на плотных и жидких питательных средах: сплошной рост, образование колоний, осадок, пленка, помутнение.

Чистая  культура- популяция одного вида микроорганизмов.

Основные принципы получения чистых культур: механическое разобщение, рассев, серийные разведения, использование элективных сред, особых условий культивирования (с учетом устойчивости некоторых микробов к  определенным температурам, кислотам, щелочам, парциальному давлению кислорода, рН и мн.др). 
 
Находясь в процессе развития в тесном взаимодействии со средой, микроорганизмы не только могут изменяться под её воздействием, но могут изменять среду в соответствии с особенностями. Так микробы в процессе дыхания выделяют продукты обмена, которые в свою очередь изменяют химический состав среды, поэтому меняется реакция среды и содержание различных химических веществ. 
Все факторы, влияющие на развитие микробов, делят на: 
• Физические 
• Химические 
• Биологические 
Ниже подробнее рассмотрим каждый из факторов.

Физические факторы

Температура 
По отношению к температурным условиям микроорганизмы разделяют на термофильные, психрофильные и мезофильные. 
• Термофильные виды. Зона оптимального роста равна 50-60 оС, верхняя зона задержки роста – 75 оС. Термофилы обитают в горячих источниках, участвуют в процессах самонагревания навоза, зерна, сена. 
• Психрофильные виды (холодолюбивые) растут в диапазоне температур 0-10 оС, максимальная зона задержки роста 20-30 оС. К ним относит большинство сапрофитов, обитающих в почве, пресной и морской воде. Но есть некоторые виды, например, иерсинии, психрофильные варианты клебсиелл, псевдомонад, вызывающие заболевания у человека. 
• Мезофильные виды лучше растут в пределах 20-40 оС; максимальная 43-45 оС, минимальная 15-20 оС. В окружающей среде могут переживать, но обычно не размножаются. К ним относится большинство патогенных и условно-патогенных микроорганизмов. 
Высокая температура вызывает коагуляцию структурных белков и ферментов микроорганизмов. Большинство вегетативных форм гибнет при температуре 60 оС в течение 30 мин, а при 80-100 оС – через 1 мин. Споры бактерий устойчивы к температуре 100 оС, гибнут при 130 оС и более длительной экспозиции (до 2 ч.). 
Для сохранения жизнеспособности относительно благоприятны низкие температуры (например, ниже 0 оС), безвредные для большинства микробов. Бактерии выживают при температуре ниже –100 оС; споры бактерий и вирусы годами сохраняются в жидком азоте (до –250 оС). 
Влажность 
При относительной влажности окружающей среды ниже 30 процентов жизнедеятельность большинства бактерий прекращается. Время их отмирания при высушивании различно (например, холерный вибрион – за 2 суток, а микобактерии – за 90 суток). Поэтому высушивание не используют как метод элиминации микробов с субстратов. Особой устойчивостью обладают споры бактерий. 
 
Широко распространено искусственное высушивание микроорганизмов, или лиофилизация. Метод включает быстрое замораживание с последующим высушиванием под низким (вакуумом) давлением (сухая возгонка). Лиофильную сушку применяют для сохранения иммунобиологических препаратов (вакцин, сывороток), а также для консервирования и длительного сохранения культур микроорганизмов. 
Влияние концентрации растворов на рост микроорганизмов опосредовано изменением активности воды как меры доступной для организма воды. И если содержание солей вне клетки окажется выше их концентрации в клетке, то вода будет выходить из клетки. Угнетение патогенных бактерий хлористым натрием обычно начинается при его концентрации около 3 процентов. 
Излучения 
Солнечный свет губительно действует на микроорганизмы, исключением являются фототрофные виды. Наибольший микробицидный эффект оказывает коротковолновые УФ-лучи. Энергию излучения используют для дезинфекции, а также для стерилизации термолабильных материалов. 
УФ-лучи (в первую очередь коротковолновые, т.е. с длиной волны 250-270 нм) действуют на нуклеиновые кислоты. Микробицидное действие основано на разрыве водородных связей и образовании в молекуле ДНК димеров тимидина, приводящем к появлению нежизнеспособных мутантов. Применение УФ-излучения для стерилизации ограничено его низкой проницаемостью и высокой поглотительной активностью воды и стекла. 
Рентгеновское и g-излучение в больших дозах также вызывает гибель микробов. Облучение вызывает образование свободных радикалов, разрушающих нуклеиновые кислоты и белки с последующей гибелью микробных клеток. Применяют для стерилизации бактериологических препаратов, изделий из пластмасс. 
Микроволновое излучение применяют для быстрой повторной стерилизации длительно хранящихся сред. Стерилизующий эффект достигается быстрым подъемом температуры. 
Ультразвук 
Определенные частоты ультразвука при искусственном воздействии способны вызывать деполимеризацию органелл микробных клеток, под действием ультразвука газы, находящиеся в жидкой среде цитоплазмы, активируются и внутри клетки возникает высокое давление ( до 10 000 атм). Это приводит к разрыву клеточной оболочки и гибели клетки. Ультразвук используют для стерилизации пищевых продуктов (молока, фруктовых соков), питьевой воды. 
Давление 
Бактерии относительно мало чувствительны к изменению гидростатического давления. Повышение давления до некоторого предела не сказывается на скорости роста обычных наземных бактерий, но в конце концов начинает препятствовать нормальному росту и делению. Некоторые виды бактерий выдерживают давление до 3 000 – 5 000 атм, а бактериальные споры - даже 20 000 атм. 
В условиях глубокого вакуума субстрат высыхает и жизнь невозможна. 
Фильтрование 
Для удаления микроорганизмов применяют различные материалы (мелкопористое стекло, целлюлоза, коалин); они обеспечивают эффективную элиминацию микроорганизмов из жидкостей и газов. Фильтрацию применяют для стерилизации жидкостей, чувствительных к температурным воздействиям, разделения микробов и их метаболитов (экзотоксинов, ферментов), а также для выделения вирусов.

Химические факторы

Способность ряда химических веществ подавлять  жизнедеятельность микроорганизмов  зависит от концентрации химических веществ и времени контакта с  микробом. Дезинфектанты и антисептики  дают неспецифический микробицидный  эффект. Бактерицидным действием  обладают химические вещества различных  групп: кислоты, щелочи, спирты, поверхностно-активные вещества, фенолы и их производные, соли тяжелых металлов, окислители, группа формальдегида, газообразные вещества и др. Большое разнообразие природы  и химической структуры указанных  веществ обусловливает и различные  механизмы их бактерицидного действия на микробную клетку. 
Бактерицидное действие кислот зависит от их электролитической диссоциации, то есть концентрации Н-ионов в растворах и их окисляющего действия. Чувствительность к кислотам различна у разных микроорганизмов. Так, показано, что если оптимальная концентрация Н-ионов для CI. botulinum соответствует 7,6 то при доведении рН до 4,6 наступает гибель этих бактерий. Самое низкое значение рН, при которой еще наблюдался рост, — это 4,8 при рН 4,7 могут прорастать только споры, а при рН 4,6 наступает прекращение роста вообще. 
Бактерицидная активность едких щелочей зависит от степени диссоциации и концентрации ОН-ионов. Наибольшей бактерицидной силой обладает КОН, затем следуют NaOH и другие щелочи. Так же как и в отношении кислот, бактерии обладают определенной щелочной устойчивостью. 
Спирты. При разведении спирт приобретает бактерицидные свойства, причем наибольшей бактерицидностью обладает 70 процентный спирт. Более высокие концентрации свертывают белок, который выпадает на поверхности бактерий и уменьшает проникновение спирта в глубь клетки. Бактерицидность спиртов увеличивается с возрастанием молекулярной массы в ряду: метиловый — этиловый — пропиловый — бутиловый — амиловый и т.д. 
Поверхностно-активные вещества — это жирные кислоты, мыла, детергенты. Все они изменяют энергетические соотношения на поверхности раздела, устремляются к поверхности раздела клетки и повреждают клеточную оболочку, не затрагивая внутренних структур клетки. 
Красители. К красителям с бактерицидными свойствами относят бриллиантовый зеленый, этакридин, флавакридин и др. В основе их действия лежит выраженное сродство с фосфорнокислыми группами нук-леопротеидов. 
Фенолы и их производные первоначально повреждают клеточную стенку, а затем и белки бактериальной клетки. 
Соли тяжелых металлов (свинец, медь, цинк, серебро, ртуть) и их соли оказывают коагулирующее влияние на цитоплазму либо на ферментные системы, связывая их сульфгидрильные группы. 
Окислители — хлор, йод, марганцовокислый калий, перекись водорода и др., окисляют существенные компоненты цитоплазмы (сульфгидрильные группы активных белков, фенольные, тиоэтильные, индольные, аминные). 
Формальдегид также денатурирует белки, он убивает как вегетативные формы, так и споры. Его применяют для обезвреживания дифтерийного и столбнячного токсинов, благодаря чему они превращаются в анатоксины. 
Химические вещества (хлор, формальдегид, щелочи, кислоты, фенол и др.) используются в практике в качестве дезинфицирующих веществ. Дезинфекция заключается в уничтожении патогенных микробов. К ней обычно прибегают для обеззараживания помещений, скотных дворов, территории. 
 
Химиотерапевтические средства проявляют избирательное противомикробное действие. 
По механизму действия противомикробные вещества разделяются на: 
а) деполимеризующие пептидогликан клеточной стенки, 
б) повышающие проницаемость клеточной мембраны, 
в) блокирующие те или иные биохимические реакции, 
г) денатурирующие ферменты, 
д) окисляющие метаболиты и ферменты микроорганизмов, 
е) растворяющие липопротеиновые структуры, 
ж) повреждающие генетический аппарат или блокирующие его функции. 
 
У микроорганизмов химической деструкции, прежде всего, подвергаются белки и липиды цитоплазматической мембраны, белковые молекулы жгутиков, фимбрий, секс-пили, порины клеточной стенки грамположительных бактерий, связывающие белки периплазмы, протеиновые капсулы, экзотоксины, ферменты-токсины и ферменты питания. Деструкция гетерогенных полимеров (белки, полиэфиры и др.) происходит как при действии окислителей, так и при действии гидролизующих и детергентных антисептиков (кислоты, щелочи, соли двух- и поливалентных металлов и др.).

Биологические факторы

К биологическим средствам могут  быть отнесены препараты, содержащие живых  особей - бактериофагов и бактерий, обладающих выраженной конкурентной активностью  по отношению к патогенным и условно-патогенным для человека и животных видам  микробов. Они вводятся в организм в жизнеспособном состоянии. Фаги и  антагонисты оказывают прямое повреждающее действие на патогенных и условно-патогенных микробов; изготовленные из них лекарственные  препараты предназначены для  местного применения, для них характерна специфичность действия на микроорганизмы и безвредность для пациента; целью  их внесения в организм человека и  животных является лечение или профилактика инфекционных заболеваний. По механизму  действия они близки к химическим антисептикам. 
Необходимо также помнить и о молочнокислых бактериях, которые вызывают процесс молочнокислого брожения. Некоторые молочнокислые бактерии способны синтезировать антибиотики и с их помощью подавлять развитие болезнетворных микробов. 
 
Препараты, содержащие бактерии (эубиотики или пробиотики): колибактерин, лактобактерин, бифидумбактерин, бификол, микрококкобактерин, линекс, бактисубтил и другие. 
Препараты, содержащие бактериофаги: бактериофаг брюшнотифозный, бактериофаг дизентерийный, бактериофаг сальмонеллезный, бактериофаг коли-протейный, бактериофаг стафилококковый, бактериофаг стрептококковый, бактериофаг пиоцианеус, бактериофаг синегнойный, бактериофаг клебсиеллезный, пиофаг комбинированный и другие.

Микроорганизмы подвержены постоянному воздействию факторов внешней среды. Неблагоприятные воздействия могут приводить к гибели микроорганизмов, то есть оказывать микробицидный эффект, либо подавлять размножение микробов, оказывая статическое действие. Некоторые воздействия оказывают избирательный эффект на отдельные виды, другие - проявляют широкий спектр активности. На основе этого созданы методы подавления жизнедеятельности микробов, которые используются в медицине, быту, сельском хозяйстве и др.