Аэробные свободноживущие азотфиксаторы

По данным академика  ВАСХНИЛ И. С. Шатилова, в неудобряемых дерново-подзолистых почвах в год  связывается 19 кг азота, а в удобряемых – 32-37 кг/га. Данные С. М. Гуревича свидетельствуют  о том, что на типичных черноземах без выращивания бобовых культур  в год связывается до 56 кг азота на 1 га.

Микроорганизмы-азотфиксаторы, находящиеся на поверхности растений и использующие органические выделения  растительных тканей, фиксируют в  год 2-10 кг азота на 1 га.[6]

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

3. Оптимальные факторы среды для развития аэробных азотфиксирующих бактерий

 

Аэробные азотфиксирующие бактерии живут в непрерывном взаимодействии с внешней средой, в которой они находятся, поэтому подвергаются разнообразным влияниям. На активность и формирование сообществ азотфиксаторов влияет ряд природных и антропогенных факторов, таких как температура почвы, ее влажность, воздушный режим почвы, кислотность, механические свойства.

Температура почвы

Температура почвы определяется географическим фактором и сезоном  года. В одной и той же зоне температурный режим зависит от  ее способности поглощать тепловые лучи, теплоизлучения, от характера растительности и т.д.

По отношению к температуре  микроорганизмы сем. Azotobacteriaceae являются мезофиллами, т.е. температурный оптимум для них составляет 30-45 ^оС, минимум – 10-15 ^оС.

Влажность

Установлено, что процессы аммонификации и нитрификации лучше всего протекают при влажности почвы, равной 60%ПВ. Оптимум фиксации азота несколько сдвинут в сторону более высокой влажности. При относительной влажности окружающей среды ниже 30% жизнедеятельность большинства азотофиксаторов прекращается.

Аэрация почвы

Азотофиксирующие микроорганизмы хорошо переносят повышенное содержание в воздухе CO₂. Нередко при этом отмечается даже улучшение их роста, тем не менее при 1-1,5% и более активность некоторых групп азотофиксаторов подавляется.

Для роста бактерии нуждаются  в элементах минерального питания, особенно в фосфоре и кальции. Потребность азотобактера в данных элементах столь высока, что его используют как биологический индикатор на наличие фосфора и кальция в почве. Для энергичной азотфиксации микроорганизмам требуются микроэлементы, из которых наиболее важен молибден, который входит в состав ферментов, катализирующих процесс усвоения азота. Отмеченные физиологические особенности характеризуют экологию данного организма. Азотобактер обитает в высокоплодородных, достаточно влажных почвах с нейтральной или близкой к ней реакции среды. При недостаточной влажности большинство клеток отмирает. В черноземных, каштановых и сероземных почвах, благоприятных для рассматриваемого организма, его обнаруживают в значительных количествах только весной. При летнем иссушении почвы остаются единичные клетки. В зоне подзолистых и дерново-подзолистых почв азотобактер можно найти в огородных и пойменных почвах, богатых органическими соединениями, с оптимальным рН 6,8...7,2. [3]

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

4. Влияние корневых выделений растений, органических удобрений, соломы, продуктов разложения клетчатки на активность фиксации азота азотобактером и размеры азотонакопления в почве

 

Способность Azotobacter chroococcum размножаться при соответствующих  условиях в ризосфере сельскохозяйственных культур дала основание предполагать, что указанный микроорганизм может улучшить азотное питание растений. По предложению академика С.П.Костычева и его сотрудников с тридцатых годов текущего столетия в нашей стране начали применять землеудобрительный препарат, содержащий культуру Azotobacter chroococcum, или азотобактерин.

Позднее, когда выяснилась способность  микроорганизма продуцировать биологически активные вещества, его действие на растения стали связывать не только с фиксацией азота и улучшением азотного питания, но и с поступлением в растения вырабатываемых микроорганизмом биологически активных соединений (витаминов и стимуляторов роста).

Весьма важное свойство азотобактера заключается в том, что он вырабатывает фунгистатическое вещество, представляющее собой метиловый эфир алифатической тетраеновой кислоты, содержащей гидроксильную и B-метильную группы. Обнаруженный антибиотик, по данным Н.И. Придачиной, активен против значительного числа фитопатогенных грибов. Благодаря описываемому свойству при бактеризации азотобактером в ризосфере угнетается развитие микроскопических грибов, многие из которых задерживают рост растений.

Работа с различными штаммами Azotobacter chroococcum подтвердила хорошее действие на растения лишь культур, вырабатывающих биологически активные вещества, поэтому при селекции для производственных целей отбирают культуры азотобактера, продуцирующие биологически активные соединения, стимулирующие рост растений, и угнетающие развитие фитопатогенных грибов. Так, культура азотобактера снимает угнетающее действие фитотоксичного гриба Alternaria на кукурузу, а рост незараженного растения стимулирует. Однако, для полевых культур азотобактерин мало эффективен. Это связано с его способностью развиваться лишь в хорошо окультуренных почвах. На унавоженных почвах положительное действие азотобактерина возрастает. Препарат хорошо влияет, например, на овощные культуры, которые обычно выращивают на сильно удобренных навозом почвах. Здесь бактеризация семян может повысить урожай на 20...30% и, что особенно важно, ускорить его созревание. Для объяснения эффективности азотобактера прежде всего следует выяснить, может ли этот микроорганизм, используя корневые выделения, накопить достаточно азота для развития растения. Опыты с монобактериальными культурами, в которых высшее растение, выращенное из стерильных семян, инокулировали культурой азотобактера, дают на этот вопрос отрицательный ответ. За счет корневых выделений бактерия не может усвоить такое количество азота, которое обеспечивало бы высокий урожай растений. Вместе с тем, при определенных условиях азотобактер улучшает рост растений. В этом можно убедиться, если в условиях монобактериальной культуры обработать им семена растений. Объясняется это тем, что азотобактер синтезирует много биологически активных соединений- никотиновую и пантотеновую кислоты, пиридоксин, биотин, гетероауксин, гиббереллин, и, возможно, ряд других соединений. Комплекс указанных веществ способен стимулировать прорастание семян, ускорять развитие растений в благоприятных условиях среды. Положительное действие азотобактера легко понять, учитывая физиологические особенности данной бактерии. Она активно размножается лишь в плодородных почвах, обеспеченных органическим веществом, фосфором и влагой. Дефицит увлажнения азотобактер переносит хуже, чем другие бактерии Известно, что в плодородных почвах присутствует спонтанная культура Azotobacter. Как же в таком случае объяснить положительный эффект дополнительного заражения? Вероятно, это связано с небольшой численностью клеток азотобактера даже в плодородной почве. При бактеризации количество бактерий сильно возрастает, особенно в ризосфере, что и создает благоприятные условия для развития корневой системы. Проявляется как стимулирующее влияние ростовых веществ, так и подавление вредной грибной флоры, а также некоторые накопления в почве доступного растениям азота.

Препарат азотобактерин  используют в основном для оранжерейной и парниковой культуры растений, или  в случае овощных культур. Обычно его готовят, размножая микроорганизм в стерильной почве или низовом торфе, имеющих нейтральную реакцию и высокое содержание гумуса. К почве добавляют источник углерода, доступный азотобактеру, например, солому. В последнее время солому часто используют как органическое удобрение. Внесение соломы обогащает почву гумусом. Кроме того, в ней содержится около 0,5% азота и другие необходимые растениям вещества. При правильном внесении соломы почва обогащается органическим веществом и в ней активизируются мобилизационные процессы включая деятельность азотофиксирующих микроорганизмов. В зависимости от ряда условий внесение 1 т соломы приводит к фиксации 5...12 кг молекулярного азота. [5]

 

Практическая часть

 

1. Объект  и методы исследования

1.1. Характеристика  взятого образца почвы.

   Для проведения  микробиологического анализа  был взял тепличный грунт, представляющий собой отработанный почвенный субстрат из теплиц и парников, рыхлый, легкий, темно-бурый или черный, как правило, крайне беден азотом и минеральными элементами. Может содержать пестициды и семена культурных растений. Характеризуется высокой пористостью (65-75%), наименьшей влагоемкостью 45-50%, воздухоемкостью 20-25%, плотностью - 0,4-0,6 г/см². Используется для выращивания овощных культур, таких как огурцы, томаты и др. Получил широкое распространение в садоводстве.

1.2. Методы биологического  исследования почвы.

1.2.1.Отбор  средней почвенной пробы для  микробиологического анализа и  требования к ней.

1. Образец должен быть  «средней почвенной пробой»: среднюю  пробу получают путем смешивания  отдельных образцов почвы (со 100 м² берут пробу из 3-х точек).

2. Образец должен отображать  характеристику исследуемой почвы:  если анализируют пахотную почву,  то пробы следует брать с  глубины всего пахотного слоя, снимая верхние 2 см почвы; если  анализируют определенный горизонт или почву по профилю – пробу берут из определенного горизонта; если анализируют весь горизонт – пробу берут начиная с нижнего горизонта.

3. Образец должен быть взят с соблюдением правил асептики (пробу берут стерильной лопаткой).

4. Образец должен иметь четкую характеристику, откуда он взят.

5. Образец должен быть свежим (анализируют в первые сутки после взятия).

6. Образец почвы должен быть однородным (тщательно перемешанным).

1.2.2. Определение влажности почвы.

Необходимо определить влажность почвы, так как полученные данные анализа при оценке результатов должны быть пересчитаны на 1г воздушно – сухой почвы. Для этого сначала взвешиваем пустой бюкс, затем помещаем в него 10-20г почвы и взвешиваем. После сушки в сушильном шкафу при 105º и достижения постоянной массы бюкс с навеской почвы снова взвешивают и определяют содержание воздушно – сухой почвы в 1г сырой.

 Влажность (А) почвы определяют по формуле:

                           А%=

где   b – масса бюкса с сырой почвой (43,7 г)

         с – масса бюкса с сухой  почвой (37,3 г)

         а – масса пустого бюкса  (23,7г)

                        А%=

 

1.2.3.Учет  численности микроорганизмов почвы.

Для учета численности  микроорганизмов в почве применяют  широко распространенный метод питательных пластин (метод Коха). Он позволяет учесть количество живых клеток в почве и выявить родовой и видовой состав, выделить чистые культуры бактерий. Но потребность в питательных веществах у различных микроорганизмов неодинакова, поэтому суспензию почвы высевают на разные среды (плотные и жидкие), предназначенные для различных физиологических групп микроорганизмов.

При посеве почвенной  суспензии на жидкие питательные  среды методом предельного разведения, численность микроорганизмов бывает несколько занижена.

 

 

 

1.2.4.Приготовление  почвенной суспензии и посев  на питательные среды.

Для проведения общего микробиологического  анализа почвы, необходимо сделать  посев микроорганизмов на плотные среды (МПА, КАА)

мясо –  пептонный агар (МПА) – учитывают количество сапрофитных микроорганизмов, использующие в качестве источника углерода органические соединения.

крахмало  – аммиачный агар (КАА) – выявляют микроорганизмы, способные использовать минеральные формы азота.

Также используют метод обрастания комочков для выявления численности определенных групп микроорганизмов:

— для выявления аэробных целлюлозоразлагающих микроорганизмов  раскладывание комочков производится на среде Гетчинсона.

— для выявления аэробных азотофиксаторов (в т.ч. Azotobacter) – на среде Эшби.

Приготовление почвенной суспензии: 10г почвы помещают в колбу емкостью 250 мл с 90 мл стерильной водопроводной воды, интенсивно взбалтывают вращательным движением (не смачивая пробки) 10 мин. Затем методом разведения готовят суспензии, содержащие разное количество почвы: из предыдущего разведения стерильной пипеткой переносят 1 мл суспензии в пробирку, содержащую 9 мл воды. В первой пробирке 1 мл суспензии, приготовленной по этому методу, соответствует разведению 10^-1.

Из полученных разведений делают посев на жидкие и плотные питательные среды.

Если численность отдельных  групп микроорганизмов в почве  небольшая, их выявляют методом обрастания комочков почвы.

 

 

 

 

2.Результаты  опыта. Учет численности микроорганизмов различных групп

Учет  количества микроорганизмов на плотных средах

Качественная и количественная оценка

микроорганизмов на МПА

 

После инкубации чашки  с засеянными средами вынимают из термостата и в них подсчитывают число колоний, которые отражают число живых клеток микроорганизмов  в почве.

Разведе- ние	Общее количество колоний	Количество микроорганизмов в 1 г абсолютно сухой почвы (КОЕ/г)	Количество  колоний доминирующих Микроорганизмов (Bacillus sp.)	Доминирующие формы микроорганизмов на 1 г (КОЕ/г)	Доля доминирующих форм в общей численности
10-4	154	2905660	122	2259259	77,75%
10-5	52	9811321	38	7169811	77,08%

 

Количество  микроорганизмов в 1г абсолютно  сухой почвы:

Общее кол-во микроорганизмов = общее.кол.колон.× разведение / влажн.     почвы

 

1. Общее кол-во микроорганизмов в 4 разв. = 154× 10⁴/ 0,53 = 2905660
2. Общее кол-во микроорганизмов  в 5 разв .= 52×10⁵/ 0,53 = 9811321

 

Количество  микроорганизмов доминирующей формы                                        в 1г абсолютно сухой почвы:

 

1. Общ. кол-во доминирующих микр. в 4 разв. = 122×10⁴/0,53 = 2259259
2. Общ. кол-во доминирующих микр. В 5 разв. = 38×10⁵/0,53 = 7169811

Доля доминирующих форм в общей численности микроорганизмов:

Общ.кол.доминирующих микр./ общ.кол.микр. ×100%

1. Доля домин.форм в 4 разв. = 2259259/2905660×100% = 77,75%
2. Доля домин.форм в 5 разв. = 7169811/9811321×100% = 77,08%

 

Признаки доминирующих микроорганизмов:

Культуральные	Морфологические
1.  Форма колонии – округлая 2.  Размер – 1,2 см  3.  Цвет – бежевый   4.  Блеск – матовый  5.  Поверхность –  гладкая   6.  Структура – однородная	1. Форма клетки - палочковидная 2. Характер расположения клеток  – хаотичный 3. Способность клеток к спорообразованию -спорообразующие